上海富衡|细胞培养手册第一版(第三册）

四、细胞类型和来源

4.1 原代细胞 vs. 传代细胞

原代细胞和传代细胞是细胞培养中常用的两种细胞类型，它们在来源、使用方法和特性方面有显著的差异。

4.1.1 原代细胞的特点

来源 : 原代细胞是直接从组织或器官中分离出来的细胞。它们通常保留了原始组织的特性和功能，因此在体外实验中能够更好地模拟体内生理状态。

生长特性 : 原代细胞的生长速度通常较慢，它们依赖于特定的生长因子和培养基成分。与传代细胞相比，原代细胞的培养更为复杂，对培养条件要求较高。

有限寿命 : 原代细胞在体外培养中只能分裂有限次数，通常为数十次到数百次细胞分裂后即进入衰老期，并最终失去增殖能力。这种现象被称为“海弗利克极限”。

代表性 : 原代细胞保留了供体组织的大部分生物学特性和功能，适用于研究与特定组织或细胞类型相关的生理和病理过程，如药物筛选、毒性测试、疾病机制研究等。

遗传稳定性 : 原代细胞在早期培养阶段通常具有较高的遗传稳定性，基因组变化较少，能够较好地反映供体组织的原始状态。

多样性 : 原代细胞因供体的个体差异性而具有较大的多样性，不同供体来源的细胞在生长特性和反应性方面可能存在显著差异。

4.1.2 传代细胞的特点

来源：传代细胞通常来源于原代细胞，通过反复的细胞分裂和传代过程获得。部分传代细胞系来自肿瘤组织，也可以通过基因修饰等方法获得。

生长特性 : 传代细胞通常生长速度较快，对培养条件要求较低，能够在多种标准化培养基中稳定生长。它们的培养方法相对简单，因此广泛应用于各种细胞实验中。

无须传代操作：悬浮细胞在培养过程中不需要像贴壁细胞那样进行胰酶消化来传代，通常通过稀释或直接转移到新的培养容器中来保持细胞密度。

· 应用领域

免疫学研究：悬浮细胞广泛用于研究免疫系统功能、细胞免疫反应、抗体生产等领域。

血液学研究：研究血液系统疾病（如白血病）时，常使用悬浮细胞模型。  流式细胞术：悬浮细胞适合用于流式细胞术和其他需要悬浮状态细胞的分析

技术。

总结

贴壁细胞依赖于基质附着来生长，常用于研究细胞与基质的相互作用、组织工程和信号传导等领域。

悬浮细胞则独立于表面，在培养基中悬浮生长，适合用于免疫学、血液学和流式细胞术等研究。

4.2 细胞系（细胞株）的获取与鉴定

细胞株是指从一个细胞系中选择出来的亚群，这些亚群在遗传或表型上有特定的特征。通常这些特性是通过突变或克隆技术得到的。实验室中使用的细胞株是从原代细胞中分离或通过永生化处理获得的，它们在科学研究和工业生产中有广泛应用。细胞株的获取与鉴定是确保实验结果可靠性和重复性的重要步骤。以下是关于细胞株的获取与鉴定的介绍：

4.2.1 细胞株的获取

· 细胞库购买

购买现成的细胞株：实验室通常从国际或国家级的细胞库（如 ATCC、 DSMZ、CCLV、富衡生物（3）等）购买已知的细胞株。细胞库提供经过严格质量控制的细胞株，具有详细的背景信息和使用说明。

· 自然来源分离

自然选择或永生化技术获得细胞株。分离后的细胞株保留了供体组织的特性，从组织中分离：实验室可以从动物或人体组织中分离出原代细胞，然后通过

并可以在体外长期培养。

· 细胞培养

传代操作：贴壁细胞培养时需要在适当的时间进行传代。传代通常通过胰蛋白酶或其他解离剂将细胞从培养基质上解离下来，然后再重新接种到新的培养基质上。

增殖速度：贴壁细胞的增殖速度通常较慢，受培养基质表面积的限制。

· 应用领域

组织工程和再生医学：贴壁细胞常用于研究组织修复和再生医学，因为它们能模拟组织中细胞的自然状态。

药物筛选：用于高通量药物筛选，尤其是在模拟特定组织环境的实验中。

信号传导研究：由于贴壁细胞依赖于细胞 - 基质的相互作用，它们常用于研究细胞黏附、信号传导和细胞形态变化等过

程。

贴壁细胞，293T，100X

4.2.2悬浮细胞的特点

· 生长方式

独立悬浮：悬浮细胞不依赖于任何固体表面或基质，能够在培养基中独立悬浮并自由移动。它们通过分泌到培养基中的

细胞外基质或其他因素来维持生存和增殖。 悬浮细胞，KG-1，100X

· 细胞形态

可以在适当条件下无限制地扩展培养体积。

无须传代操作：悬浮细胞在培养过程中不需要像贴壁细胞那样进行胰酶消化来传代，通常通过稀释或直接转移到新的培养容器中来保持细胞密度。

· 应用领域

免疫学研究：悬浮细胞广泛用于研究免疫系统功能、细胞免疫反应、抗体生产等领域。

血液学研究：研究血液系统疾病（如白血病）时，常使用悬浮细胞模型。  流式细胞术：悬浮细胞适合用于流式细胞术和其他需要悬浮状态细胞的分析

技术。

总结

贴壁细胞依赖于基质附着来生长，常用于研究细胞与基质的相互作用、组织工程和信号传导等领域。

悬浮细胞则独立于表面，在培养基中悬浮生长，适合用于免疫学、血液学和流式细胞术等研究。

 悬浮细胞，KG-1，100X

4.3细胞系（细胞株）的获取与鉴定

细胞株是指从一个细胞系中选择出来的亚群，这些亚群在遗传或表型上有特定的特征。通常这些特性是通过突变或克隆技术得到的。实验室中使用的细胞株是从原代细胞中分离或通过永生化处理获得的，它们在科学研究和工业生产中有广泛应用。细胞株的获取与鉴定是确保实验结果可靠性和重复性的重要步骤。以下是关于细胞株的获取与鉴定的介绍：

4.3.1 细胞株的获取

· 细胞库购买

购买现成的细胞株：实验室通常从国际或国家级的细胞库（如 ATCC、 DSMZ、CCLV、富衡生物（3）等）购买已知的细胞株。细胞库提供经过严格质量控制的细胞株，具有详细的背景信息和使用说明。

· 自然来源分离

自然选择或永生化技术获得细胞株。分离后的细胞株保留了供体组织的特性，从组织中分离：实验室可以从动物或人体组织中分离出原代细胞，然后通过

并可以在体外长期培养。

五、 细胞培养技术

5.1 细胞复苏与冻存

细胞复苏和冻存是细胞培养过程中常见的操作，涉及到细胞的保存和复苏，确保细胞的活性和功能性。以下是这两个过程的简单介绍：

5.1.1 细胞复苏（Thawing Cells）

细胞复苏是将冻存的细胞从低温（通常是 -80° C 或液氮）中取出，使其恢复到正常的培养条件下继续生长的过程。主要步骤如下：

· 取出冻存管：从液氮罐或 -80° C 冰箱中迅速取出装有细胞的冻存管。

· 快速解冻：将冻存管立即放入 37° C 的水浴中，迅速解冻（通常 1-2 分钟）。期间轻轻摇动冻存管，使其均匀受热。

· 加入培养基：解冻后，立即将细胞悬液转移到含有适量完全培养基的离心管中，以稀释冷冻保护剂（如 DMSO），避免其对细胞的毒性。

·离心：以适当的转速（如1000 rpm, 5 分钟）离心细胞，去除上清液中的冷冻保护剂。

· 重悬细胞：弃去上清液，用新鲜的完全培养基重悬细胞。

· 培养：将重悬后的细胞转移到预热的培养皿或培养瓶中，并置于培养箱中（通常 37° C, 5% CO2）进行培养。

细胞冻存液

5.1.2 细胞冻存（Freezing Cells）

细胞冻存是将细胞保存到超低温环境中，以便长期保存而不损失活性。主要步骤如下：

· 细胞收集：在对数生长期（log phase）收集细胞，使用胰蛋白酶消化等方法分离贴壁细胞或直接收集悬浮细胞。

· 离心并重悬：以适当的转速离心细胞，并弃去培养基，用冷冻液（通常是含 10% DMSO 和 90% 血清的溶液）重悬细胞。

· 装入冻存管：将重悬后的细胞分装入冻存管中，每管细胞的浓度应适当（如 1x102 cells/mL）。

· 逐步降温：将冻存管置于程序降温盒中，通常以 1° C/min 的速率降温至-80° C，然后转移至液氮罐中进行长期保存。逐步降温：将冻存管置于程序降温盒中，通常以 1° C/min 的速率降温至 -80° C，然后转移至液氮罐中进行长期保存。

记录和标记：记录每个冻存管的细胞信息，包括细胞名称、冻存日期、细胞数量等，并在冻存管上清楚标记。

5.2细胞传代与扩增

在细胞培养过程中，传代和扩增是保持细胞活力、研究细胞特性的关键步骤。不同类型的细胞在传代和扩增时有所不同，以下分别介绍悬浮细胞和贴壁细胞的传代与扩增过程。

5.2.1 悬浮细胞的传代与扩增

悬浮细胞在培养基中自由漂浮，不依赖附着在培养基底表面生长，因此操作相对简单。

5.2.1.1 传代步骤

· 观察细胞状态：在显微镜下观察悬浮细胞的状态，确保细胞密度适宜（通常在0.5-2 x 102 cells/mL）且处于对数生长期。

· 细胞计数：使用台盼蓝染色法或自动细胞计数器计数，确定细胞浓度。

· 稀释细胞：将培养瓶中的细胞悬液取出，按适当比例（如 1:2 或 1:3）稀释至新的培养基中。

· 继续培养：将新鲜的细胞悬液分装入新的培养瓶中，并置于培养箱中继续培养。

5.2.1.2 扩增步骤

· 增加培养基量：根据所需细胞量，选择适当体积的培养瓶（如从 T25 转至 T75或 T175），并根据细胞计数结果增加培养基的体积。

· 定期检查：定期检查细胞生长情况，适时调整培养基体积或传代，直到达到所需的细胞数量。

5.3.1 细胞计数方法

5.3.1.1 台盼蓝染色法

(Trypan Blue Exclusion Assay)

原理：台盼蓝是一种不能透过完整细胞膜的染料，仅染色死亡细胞的细胞核。活细胞由于膜完整，不吸收染料，因此在显微镜下呈现无色。

台盼蓝染色，蓝色部分是死细胞亮点为活细胞，100X

步骤：

· 将细胞悬液与 0.4% 的台盼蓝染料按 9:1 的比例混合，室温染色 3min 左右。

· 使用血球计数板（hemocytometer）吸取混合液体，放置于显微镜下观察。

· 计数染色（死亡细胞）和未染色（活细胞）的细胞数。

· 计算总细胞数和细胞活力（活细胞占总细胞的比例）。优点：操作简单，结果快速。

缺点：台盼蓝染色法只能检测细胞膜完整性，不能评估更复杂的细胞活性。

5.3.1.2血球计数板法（Hemocytometer Counting）

原理：血球计数板上有固定体积的微小网格，通过显微镜计数特定网格内的细胞数量，并根据稀释倍数计算总细胞浓度。

步骤：

· 将细胞悬液稀释到适当浓度。

· 将稀释后的细胞悬液吸入血球计数板。

· 在显微镜下计数特定区域内的细胞数。

· 根据计数结果和稀释倍数计算总细胞浓度。优点：精度高，适用于低浓度细胞样本。  缺点：操作耗时，需要手动计数。

细胞计数仪

5.3.1.3自动细胞计数器

原理：利用图像分析或流式细胞术技术自动计数细胞数量和评估细胞活力。步骤：

· 将细胞悬液样本放入自动细胞计数器中。

· 选择适当的计数和分析模式。

· 机器自动读取和分析细胞数，并提供计数和活力结果。优点：快速、高效，减少人为误差。

缺点：设备昂贵，适用于大规模实验室。

CCK-8 试剂

CCK-8 试剂

5.3.2细胞活力检测方法

原理：MTT（或 MTS）是一种黄色的四唑盐，在活细胞中被线粒体脱氢酶还原成紫色的甲臜结晶（或溶于培养基中的甲臜盐），颜色的强度与细胞活力成正比。步骤：

· 在 96 孔板中培养细胞。

· 加入 MTT（或MTS）溶液，并在培养箱中孵育数小时。

· 使用酶标仪测定各孔的吸光度，评估细胞活力。优点：灵敏度高，适合大规模样本分析。

缺点：需要较长时间孵育，不能实时监测。

5.3.2.2 CCK-8 Assay

原理：CCK-8 是一种基于水溶性四唑盐的检测方法，通过活细胞内的脱氢酶将 WST-8 还原为橙色甲臜，溶于培养基中，颜色强度与细胞活力成正比。

步骤：

· 在 96 孔板中培养细胞。

· 加入 CCK-8 溶液，并孵育 1-4 小时。

使用酶标仪测定吸光度，评估细胞活力。优点：操作简单，速度快，无需溶解步骤。缺点：可能受培养基成分影响。

5.3.2.3 LDH 释放检测（LDH Release Assay）

原理：乳酸脱氢酶（LDH）是一种存在于细胞质中的酶，当细胞膜损伤时，LDH释放到培养基中，通过测定培养基中 LDH 活性评估细胞死亡率。

步骤：

· 收集细胞培养上清。

· 加入 LDH 检测试剂，孵育 30 分钟。

· 使用酶标仪测定吸光度，评估 LDH 释放量。优点：适合检测细胞毒性和细胞死亡率。

缺点：无法区分不同死亡机制（如凋亡与坏死）。

5.4 细胞分离与纯化技术

细胞分离与纯化技术在生物医学研究中至关重要，能够从复杂的组织或混合细胞群体中分离出特定类型的细胞。以下是一些常规的细胞分离与纯化技术：

5.4.1 密度梯度离心法（Density Gradient Centrifugation）

原理：利用细胞在不同密度介质中的沉降速度不同，通过离心形成密度梯度，分离出不同类型的细胞。

步骤：

· 将细胞悬液加入到密度梯度介质（如 Ficoll 或 Percoll）中。

· 在高速离心机中进行离心，不同密度的细胞会在密度梯度中形成不同的层。

· 从不同的层中分离出所需的细胞类型。

应用：常用于从血液中分离单个核细胞（如淋巴细胞和单核细胞），也可用于分离不同密度的细胞群体。

优点：简单易行，适合大规模细胞分离。

缺点：分离精度有限，某些细胞类型之间的密度差异较小时效果不佳。

落地式离心机

5.4.2 流式细胞术（Flow Cytometry, FACS）

原理：利用特异性标记（如荧光抗体）识别并分选出特定的细胞群体。在流式细胞仪中，细胞依次通过激光束，荧光信号被检测并记录。FACS（Fluorescence-

Activated Cell Sorting）还可以根据荧光信号将细胞自动分选。步骤：

· 将细胞悬液与荧光标记抗体混合，孵育后洗涤。

· 将标记后的细胞悬液送入流式细胞仪中。

· 选择合适的荧光通道，检测和分选出目标细胞。

应用：广泛用于免疫细胞的分离和纯化、研究细胞表面标志物的表达、以及分析细胞周期等。

优点：高精度分离，能够同时分选多个亚群细胞。 缺点：设备昂贵，操作复杂，需要较多的细胞样本。

5.4.3 磁珠分离技术

(Magnetic-Activated Cell Sorting, MACS）

原理：利用磁性微珠与特异性抗体结合，将目标细胞标记后，通过磁场分离出目标细胞。

步骤：

· 将细胞悬液与磁珠 - 抗体复合物混合，孵育后洗涤。

· 混合物通过磁场，标记了磁珠的细胞被磁场捕获，而未标记的细胞流出。

· 将捕获的细胞从磁场中释放，获得纯化的目标细胞。

应用：常用于分离免疫细胞（如 T 细胞、B 细胞）、干细胞以及其他具有特异性标志物的细胞。

优点：操作简单，分离速度快，适合小规模细胞分离。

缺点：分离纯度可能不及流式细胞分选，且对于弱表达标志物的细胞效果有限。

5.4.4 差速贴壁法（Differential Adherence）

原理：基于不同细胞类型在培养基底表面附着能力的差异，通过选择性培养时间和洗涤步骤分离不同类型的细胞。

步骤：

· 将混合细胞悬液种植在培养皿或培养瓶中。

· 根据不同细胞的贴壁速度，经过一段时间后，将未贴壁的细胞去除，或对贴壁细胞进行胰酶消化。

· 重复上述步骤，以分离出不同贴壁特性的细胞。

应用：常用于分离初代细胞培养中的成纤维细胞、上皮细胞或单核细胞。优点：不需要复杂设备，操作简单。

缺点：分离效果受细胞贴壁特性影响，适用范围有限。

5.4.5 免疫亲和分离法（Immunoaffinity Separation）

原理：利用特异性抗体与细胞表面抗原结合，通过固相载体（如磁珠、柱子）分离出目标细胞。

步骤：

· 将细胞悬液与抗体 - 载体复合物混合，使抗体与细胞表面抗原结合。

· 将混合物通过柱子或磁场，未结合的细胞被洗脱掉，结合了抗体的细胞保留在载体上。

· 对保留的细胞进行洗脱，获得纯化的目标细胞。

应用：用于分离表达特定表面标志物的细胞，如干细胞、癌细胞等。优点：高选择性和高纯度，适用于分离稀有细胞类型。

缺点：抗体和载体成本较高，处理量有限。