上海富衡|细胞培养手册第一版(第二册）

二、细胞培养实验室准备

2.1 细胞培养实验室的布局

细胞培养实验室的布局设计至关重要，因为它直接影响实验的效率、安全性和成功率。一个良好的细胞培养实验室应该确保无菌操作、环境控制以及设备的合理分布。以下是细胞培养实验室的基本布局及各个区域的功能介绍：

· 实验室入口区

功能：入口区是实验人员进入实验室前的缓冲区域。通常设有更衣区和清洁区，以确保实验人员进入实验室前达到无菌要求。实验人员应在此处更换实验服、戴上手套、帽子和口罩，以减少实验室的污染风险。

· 无菌操作区

功能：这是进行细胞培养的核心区域。无菌操作区通常配备有超净工作台，用于确保在进行细胞培养操作时，细胞不会受到外界微生物的污染。

设备：该区域应配备超净工作台、酒精喷雾瓶、灭菌器具、台式离心机等。超净工作台应远离门口、通风口等气流可能扰动的区域，以维持内部的无菌环境。

· 培养区

功能：培养区是细胞培养物实际放置和生长的地方。这里通常安放细胞培养箱，用于为细胞提供恒温、恒湿和适宜的 CO2 环境。

设备：CO2 培养箱、倒置显微镜（用于观察细胞形态）

· 器材准备区

功能：器材准备区用于准备实验所需的培养基、缓冲液、试剂、耗材等。这里的工作台和存储柜应清洁整齐，方便实验人员取用。

设备：无菌耗材存储柜、低温冰箱（用于存储细胞培养基、血清等）。无菌操作区、培养区和器材准备区之间，应设有物品传递窗。

· 空气净化系统

功能：空气净化系统是确保实验室环境洁净度的重要组成部分。HEPA 过滤器可用于过滤空气中的微粒，保持实验室内部空气的清洁。

布局：空气净化系统应贯穿整个实验室，并特别集中于无菌操作区和培养区，以确保这些区域的空气质量达到标准要求。

三、细胞培养基础知识

3.1 细胞培养的基本流程

细胞培养是一种在体外环境中生长和维持细胞的技术，广泛应用于生物医学研究、药物筛选、基因研究等领域。其基本流程包括以下几个步骤：

细胞获取：从动物或人体组织中分离出细胞，或从细胞库中复苏冷冻保存的细胞。

细胞接种：将细胞悬浮液接种到含有适当培养基的培养皿或培养瓶中。培养基提供细胞生长所需的营养物质、激素和适当的 pH 值、渗透压环境。

细胞培养：将接种好的细胞置于培养箱中，通常在 37° C、5% CO2 环境下培养。定期观察细胞的生长状态，并更换培养基以去除代谢废物和补充新的营养。

细胞传代：当细胞达到一定密度时，通过胰蛋白酶或其他方法将细胞从培养基质上分离，并重新接种到新的培养器皿中，以继续生长。这一过程称为传代培养。

细胞检测：在培养过程中，常需进行细胞计数、活力测定、显微观察等检测，确保细胞健康生长，并记录实验数据。

终止培养或收获细胞：根据实验需要，在合适的时机终止培养，收获细胞用于后续实验，如 DNA 提取、蛋白质分析、功能实验等。

3.2 常见培养基的种类

常见的基础细胞培养基有多种类型，它们为细胞提供基本的营养成分、能量来源、维生素、矿物质和氨基酸。可简单分为基础培养基和无血清培养基两大类。现在市场上广为流传的完全培养基，实际是基础培养基加上一定比例的血清配置而成。

以下是一些常见的基础细胞培养基：

· EMEM（Eagle's Minimum Essential Medium）

特点：含有基本的氨基酸、维生素、盐和葡萄糖，葡萄糖浓度较低。应用：适用于多种贴壁细胞和悬浮细胞的培养。

应用：广泛用于干细胞、骨髓细胞、免疫细胞等的培养。

· L-15（Leibovitz's L-15 Medium）

特点：设计用于无 CO2 环境，含有高浓度的氨基酸和维生素。

应用：适用于室温下短期培养或缺乏 CO2 培养条件下的细胞培养。

· DMEM/F12

特点：结合了 DMEM 的高营养需求和 F12 的多种微量元素和维生素。

应用：广泛用于多种类型的细胞，尤其是需要高营养的细胞，如干细胞和神经元细胞。

无血清培养基是一种不含动物血清的培养基，广泛应用于减少血清带来的变异性和外源因子的影响，尤其在生物制药、基因治疗、免疫学研究等领域中尤为重要。以下是一些常见的无血清培养基种类： 

· CHO 培养基

特点：专门为中国仓鼠卵巢细胞（CHO 细胞）设计的无血清培养基，常用于生产单克隆抗体和重组蛋白。

应用：用于生物制药中 CHO 细胞的大规模培养和表达系统，支持高密度细胞培养和高产量蛋白生产。

· HEK293 培养基

特点：适用于人胚胎肾细胞（HEK293 细胞）的无血清培养，能够提供足够的营养成分以支持细胞生长和蛋白质表达。

应用：广泛用于基因表达研究、病毒载体生产和重组蛋白生产。

· NS0 和 SP2/0 培养基

特点：适用于鼠骨髓瘤细胞系（如 NS0 和 SP2/0 细胞）的无血清培养。应用：常用于单克隆抗体生产中的母细胞系培养。

· 干细胞培养基

特点：用于维持和扩增多能干细胞或特定类型干细胞的无血清培养基，如 mTeSR、StemPro 等。

应用：支持人类胚胎干细胞（hESC）和诱导多能干细胞（iPSC）的无血清培养，维持其未分化状态和多能性。

· 神经元培养基

特点：如 Neurobasal 培养基，设计用于神经元细胞的无血清培养，通常搭配 B27 或 N2 补充剂。

应用：用于中枢神经系统神经元的培养，支持神经元的生长、分化和存活。

· Vero 细胞培养基

特点：适用于非洲绿猴肾细胞（Vero 细胞）的无血清培养，支持病毒生产和疫苗研发。

应用：常用于病毒增殖、疫苗生产和生物医学研究。

· 293T 细胞培养基

特点：专为 293T 细胞设计的无血清培养基，支持高效病毒生产和重组蛋白表达。

应用：广泛用于病毒载体、基因编辑和蛋白质生产等领域。

· Hybridoma 培养基

特点：设计用于杂交瘤细胞（Hybridoma）的无血清培养基，能够促进抗体生成和细胞生长。

应用：用于单克隆抗体的生产，减少血清带来的杂质和免疫原性。

· Expi293 和 ExpiCHO 培养基

特点：专门用于 Expi293 和 ExpiCHO 表达系统的无血清培养基，优化了蛋白质生产的产量和质量。

应用：高效的瞬时表达系统，广泛应用于蛋白质生产和疫苗开发。

· Corning Cellgro 无血清培养基

特点：多用途的无血清培养基，适用于多种哺乳动物细胞的培养，提供了一种通用的无血清环境。

应用：用于不同细胞系的培养，尤其是在不确定细胞对特定成分需求的情况下。

· 人 AB 血清（Human AB Serum）

是一种由 AB 血型健康人类献血者提供的血清。它在细胞培养、免疫研究和临床实验中有着广泛的应用，尤其是在需要避免其他血型抗体干扰的情况下。

特点：无抗 A 和抗 B 抗体，由于 AB 血型人群体内没有抗 A 或抗 B 抗体，因此该血清不会与 A 型或 B 型抗原发生反应。这使得人 AB 血清成为许多细胞培养和免疫学实验的理想选择，因为它减少了抗体介导的细胞反应或免疫干扰的风险。应用：人 AB 血清适用于多种人类细胞系的培养，尤其是原代细胞、干细胞

和免疫细胞的培养。它也常用于需要人类特定环境条件的体外实验中，如个性化医学研究和细胞疗法开发。

在实验中，为了满足不同细胞类型和实验需求，常用的胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）可以经过特殊处理，以改善其特定功能或去除某些成分。这些特殊类型的 FBS 在研究和生产中有着广泛的应用。以下是几种常见的特殊类胎牛血清：

· 热灭活胎牛血清（Heat-Inactivated FBS）

特点：通过加热处理（通常在 56° C 加热 30 分钟），灭活补体和一些酶，但保留大部分生长因子和蛋白质。

应用：常用于免疫学实验和细胞培养中，特别是在需要减少补体活性或避免某些酶的影响的情况下，如淋巴细胞培养、抗体生产等。

· 低 IgG 胎牛血清（Low IgG FBS）

特点：通过特定工艺降低 FBS 中免疫球蛋白 G（IgG）的含量。

应用：用于减少细胞与免疫球蛋白相互作用的实验，特别是在单克隆抗体生产和免疫疗法研究中，低 IgG 水平有助于减少抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和其他免疫反应。

· 碳吸附胎牛血清（Charcoal/Dextran-Treated FBS）

特点：通过活性炭和右旋糖酐处理，去除了血清中的激素、脂类和其他小分子代谢物。

应用：用于激素研究和受激素影响的细胞实验，如内分泌研究和激素反应实验，有助于研究特定激素或药物的作用而不受血清中天然激素的干扰。

· 四环素阴性血清（Tetracycline-Free Serum）

特点：去除了血清中的四环素类抗生素，如四环素（Tetracycline），以避免其对细胞生长、实验结果和细胞行为的干扰。血清中的其他重要成分（如生长因子、激素和蛋白质）通常会被保留，确保细胞仍然可以在良好的培养环境中生长。

应用：在某些细胞转染系统中，四环素可能会干扰基因表达系统的调控。使用四环素阴性血清可以确保基因表达系统的正常运行，不受外源四环素的干扰。

这些特殊类型的胎牛血清通过特定处理或筛选，能够满足特定实验的要求。选择合适的胎牛血清类型对于实验的成功和结果的可靠性至关重要。