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Pull down实验技术服务
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辉骏生物
蛋白质组学、核酸蛋白互作、分子细胞生物学、抗体测序、抗体表达等实验技术服务专家!专业技术团队与实验设备,10年金牌品质服务,是您可信赖的生物医药科研好伙伴!实验服务咨询、整体课题研究合作请电辉骏全国免费服务热线:400-699-1663
一.Pull down 的概念—辉骏生物 在Pull down实验中,带有标签的诱饵蛋白被特异结合该标签的固相化亲和配基捕获,产生“次级亲和支持物”,用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。固相化诱饵蛋白的次级亲和支持物可以与含有推测猎物蛋白的各种蛋白样品相互孵育,如果缓冲液及样品条件与靶结合相互作用兼容,且诱饵蛋白在带有标签和被固相化时仍然可以行使功能,那么存在于样品中的猎物蛋白就会结合到亲和支持物上,“诱饵-猎物复合体”可从支持物上洗脱下来。二.Pull down实验流程—辉骏生物 图1. Pull down流程示意图三.Pull down实验方案设计—辉骏生物1.构建带标签的诱饵蛋白原核表达载体(带his或GST标签);2.载体转化大肠杆菌,表达诱饵蛋白(这一步比较关键,很多蛋白原核表达会形成包涵体,极大影响后续实验,我们采用自诱导培养基培养细菌,使得包涵体形成的几率大大降低);3.细菌裂解液过柱子,带标签的诱饵蛋白被特异结合标签的固相化亲和配基捕获,产生“次级亲和支持物”;4.待测样品裂解液过柱子孵育,与诱饵蛋白互作的蛋白被“次级亲和支持物”吸附;5.清洗,离心,去除未结合的杂蛋白;6.洗脱,得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物;7.如要验证某个蛋白X与诱饵蛋白互作,则将6.所得的蛋白复合物与X蛋白的抗体孵育,做Western blot验证;8.如要寻找诱饵蛋白可能的互作蛋白,则将6.所得的蛋白复合物进行LC-MS/MS鉴定;图2. Pull down实验流程 图2. Pull down实验方案图四.生物信息学分析—辉骏生物五.Pulldown实验技术服务内容—辉骏生物
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