DNA片段原位标记
Uhouuhou
凋亡细胞DNA片段原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate,UDTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidy1 transferase,TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3'的羟基(-OH)端相结合经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
DNA片段原位标记法有两种:(1)原位缺口转移(in situ nick-translation,ISNT)技术,该技术是1994年由Fehsel等提出,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸接到断裂的3'-OH端;(2)原位缺口末端原位标记技术(in situ end labelling technique,ISEL), 该技术即TUNEL法,于1993年由Wijsman等提出, 它是利用TdT将标记DUTP接到3'-OH端。研究证明,TUNEL的敏感性远高于尤其对早期凋亡的检出TUNEL更为适用。其原因可能是凋亡发生时DNA大多是双链同时断裂而单链断裂少见。ISNT是依赖DNA多聚酶I的单链修复反应,故阳性率较低。细胞凋亡时DNA断裂早于形态学改变及DNA含量减少。因此该法较前述各法具有更高的灵敏性,但环死细胞亦有DNA裂点形成。因此环死亦可呈TUNEL阳性反应。
有没有可用于96孔培养板的细胞凋亡试剂盒
brightpearl:我欲观察多种药物对神经细胞凋亡的影响,工作量较大,现市售细胞凋亡试剂盒TUNEL用于培养皿。有没有可用于96孔培养板的细胞凋亡试剂盒?
XTYang:bdbiosciences下属clontech子公司有的
个人做调亡的体会 ljksbs
如果是做细胞调亡的形态学观察,姬姆萨染色比较好;现在检测调亡比较流行的是Annexin-V FITC/PI双染,将细胞分为正常细胞,早期调亡细胞,晚期调亡细胞或继发性坏死细胞,机械性损伤细胞四个区域,比较敏感,不错。
DNA Ladder 法检测细胞调亡,是检测细胞的晚期调亡,但是注意此法虽为检测细胞调亡经典的方法观察阶梯状条带,但是不是很灵敏,如果晚期调亡率少于10%(有的说是30%)很难观察到断裂的DNA 阶梯状条带。
PI单染是检测晚期调亡,但是如果早期有调亡无法发现。
ELISA法检测细胞调亡现已很少见有文章使用。
还有一种检测调亡现在比较时髦的是TUNEL法,此法最为经典的是观察组织切片中的细胞调亡情况,也可以用于观察单细胞悬液的调亡情况,但是需要做细胞爬片,有一个缺点是如果是人工计数的话,误差比较大,国外的文章都是电脑计数,这样比人工要准确,但是由于经费问题,现在国内使用此法人工计数的不在少数,因此这样可信度就不高。
如果要探讨调亡机理,可以结合免疫组化法来检测如bcl-2,fas等调亡蛋白的表达。
ELISA方法检测淍亡的原理 DONGHAIJU
细胞凋亡时,Ca2+,Mg2+离子依赖的内源性核酸内切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断,产生单或寡合苷酸小体,各核小体的DNA与核组蛋白H2A,H2B,H3,H4形成紧密的复合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。主要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。
其他
雕刻者:我准备做一些肿瘤的石蜡标本。 我想提取里面的血管内皮细胞,然后用流式观察它的凋亡情况 。我想问的是根据单细胞悬液制备后如何能分离出血管内皮细胞? 另外是否有必要用流式还是用TUNEL法就可以了
yqzhan:做成蜡块的组织被固定了,蛋白质变性,细胞间的连接被固定,加上固定液加强了细胞间的交联,理论上是不可能进行分离的。 为什么不直接在组织切片上进行凋亡检测呢?
eeflying:血管内皮不用分离,作双标就可以了。 建议在流式专区问问, 这对于他们挺简单的问题。
dinki:有一个困惑的问题:在我看来,细胞流式仪检测凋亡既可以定性又可以定量,那为什么绝大多数实验室仍要同时用TUNEL法来进行定性呢?而且,现在对于TUNEL法检测凋亡存在一定的争议:并不是只有发生凋亡的细胞表现TUNEL(+)。那么对细胞凋亡的检测是否只需细胞流式仪就足够了呢?
midas:我认为:因为目前除了电镜是检测凋亡的金标准外,其他的方法均有一定的不足,所以一般都会用到两种以上的方法对细胞调亡进行检测,如:流式+荧光染色,荧光染色+DNAladder等等。
TUNEL的方法是体内试验时检测调亡的常用方法,而流式对体内细胞的调亡则无能为力。
XSQ:我最近的实验很不顺,我将载玻片用左旋多聚赖氨酸包被后放与六孔板中,但是很容易污染,不知各位高手有何高招.
midas:载玻片、PLL、六孔板、培养液及玻片确保无菌,最重要的无菌操作技术!
haiyang777:老师上课时说过,如果以细胞凋亡电镜照片为证据时,一定要同时附带一张细胞大量凋亡的光镜照片以说明问题。因为正常细胞也会有凋亡发生,只有电镜的不能说明问题的。