悬浮细胞原位杂交合荧光标记检测凋亡
pljgirl: 请教悬浮细胞原位杂交合荧光标记检测凋亡的经验。我现在想拿这些悬浮的细胞检测其凋亡情况和做原位杂交,不知道细胞如何贴到载波片上,应该用何固定液固定?固定后如何保存?
XTYang: 用Cytospin甩到载玻片上。固定用甲醇、乙醇、paraformaldehy都可以,要根据具体实验而定的。
pljgirl: 我的细胞是加了一种新药,不同的剂量,想看药物诱导细胞凋亡的情况,用cytospin时每组细胞要求甩的细胞数一样吗?因为我收的时候,发现对照组的细胞很多,最大加药组的细胞少得很,如果用同样得体积,可能对照组的细胞重叠了,而加药组的确很稀疏。所以甩细胞时要准确计数吗?
XTYang: 用cytospin时每样品的细胞数最好大致一样,不然照相时细胞少的那个样品就很难找到好视野。太多细胞重叠也不行。我印象里是10^4-10^5个,不过不很肯定,你做个试验看看镜检结果就知道了。既然是大致,就不必准确计数。
pljgirl:那这样的话,将来片子还用于统计吗?我看到有些文献上说在对阳性部位进行分级,<25%为阴性,25%~50%(+)>50%(++)等,那如果不精确计数,甩的细胞数目不一致,怎么有可比性呢?
XTYang: 凋亡%可比
pljgirl: 你意思是说,用流式细胞仪检测凋亡率来比较,甩片只是为了获得形态学的标记,不用比较凋亡率吗?
XTYang: 不是。镜检可以同时获得形态和凋亡率的数据(虽然数起来辛苦),因为不管你甩多少细胞上去,其中的凋亡细胞占总体细胞中的%是固定的,因此用CYTOSPIN时细胞计数不很准确也不要紧,应为%固定。甩细胞时计数不必准确不等于镜检计算凋亡细胞%时计数不必准确。后者尽量准确为好。
pljgirl:再请教一下,我想做荧光标记凋亡和细胞的原位杂交,但现在还没选好试剂,可能会用promege的tunel,原位杂交也没想好要检测rna或dna,只是想甩片后固定,将细胞保存在-80度,做这两项内容的细胞都可以用4%的多聚甲醛在4度固定30分钟就行了?听说做rna的原位杂交固定用的多聚甲醛要用DEPC水来配,又相关经验提供吗?
XTYang:我没试过先保存一段时间然后再做的方法。一般固定后就直接做了。普通的用-20度甲醇或乙醇固定2-16小时,需要用多聚甲醛的话,可以在甲醇或乙醇固定后再进行。
做rna的原位杂交固定用的多聚甲醛要用DEPC水来配的说法我没听说过,希望你做了以后和大家分享成功经验。
pljgirl:我也是在丁香园里看到别人建议的,其实也有点道理,DEPC水是去rna酶的,感觉做rna的实验就是要严格很多。我在现代病理学技术中查到做原位杂交一般都是用4%的多聚甲醛固定,再用80%的乙醇后固定。由于我的细胞已经收集好冻存了,解冻后马上要甩150多张片,现在急啊!万一固定方法不对。我的损失会很惨重!悬浮细胞的固定是在率片前还是再率片后呢?
XTYang: 我学的做的都是先甩后固定。
关于凋亡率
sabc128:我做的是药物作用于细胞一定时间后,计算细胞的凋亡率是多少?有那些方法?
youngtiger:可以通过以下三个方面着手:
(一)通过凋亡形态学:常规染色(HE, Giemsa, Wright)的普通光学显微镜观察,随即选择视野进行凋亡细胞计数;透射电镜观察。
(二)通过凋亡的生化特征检测:琼脂糖凝胶电泳末端标记定量检测;原位末端标记检测(TUNEL等)
(三)通过流式细胞仪:PI单染色法;TUNEL的流式分析等