7. 电泳
7.1 PAGE胶的制备
不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度(参考下表),原则上高分子量蛋白用低浓度胶,低分子量蛋白用高浓度胶分离。
不同浓度的凝胶的配制方见公司提够的相关试剂盒说明书,首先配制各组分贮备液,然后分别配制浓缩胶和分离胶。
7.2蛋白分子量Marker
预染或非预染各种分子量的蛋白,用于标示电泳中蛋白的大小和示踪
7.3阳性对照
目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物,用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率。建议使用该对照。可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提该对照样本。
7.4内参对照
管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白,用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作,并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照。必须设立。
7.5上样与电泳
每孔上样量为20-40 μg蛋白,使用专用枪头或注射针头,勿溢出加样孔,电泳时间按电流仪说明书推荐方法使用,(1小时或过夜,取决于电压大小),当染料到达胶的底部,关电源停止电泳,胶不能存放,应立刻进行下一步的转膜。
8. 转膜与显色(Western Blot)
8.1胶中蛋白的检测
电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均,可采用铜染或考马斯蓝染色检测,如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的铜染法,否则采用不可逆考马斯蓝法染色。
铜染法:电泳胶用蒸馏水洗数秒钟,加入0.3 M CuCl2染色5-10分钟,再用去离子水洗一次,在暗背景下观察在兰色胶背景下蛋白出现透明条带,胶置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0缓冲液中漂洗脱色两次,再置于电转缓冲液中开始转膜。
考马斯蓝法:用40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇的溶液固定胶中蛋白,考马斯蓝R-250染液(凯基产品)室温染色4小时至过夜,保持摇匀,转入67.5%双蒸水, 7.5% 醋酸, 25%甲醇l摇匀至脱去多余的染料,蛋白被染成深蓝色。
8.2蛋白转膜
蛋白因结合SDS而带电荷,在电场下从胶中转至膜上,转膜操作根椐电转仪制造商的说明书进行转膜方式分为半干和湿转两种,半干式转膜速度快,而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD的蛋白。
湿式转膜三明治排列为:海绵/纸/胶/膜/纸/海绵,全部紧密排列,特别是胶/膜之间不能留有气泡,三明治安放的方向确认正确负极方为带负电的胶里的蛋白,向正极方(膜)电迁移。标准的电转缓冲液为1X Tris-glycine buffer 不含SDS,但加入20%甲醇,如果转膜的蛋白分子量大于80KD,则推荐加入SDS使之终浓度为0.1%。
半干式转膜中,三明治的排列为:/纸/胶/膜/纸,用电转缓冲液浸湿后,直接置于电转仪的正负极之间。胶于负极而膜置于正极。半干式的电转缓冲液可不同于湿式的电转缓冲液,推荐为:48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇,
两类膜可供选择:硝酸纤维素膜和PVDF膜(正电荷尼龙膜),根据不同需要选择(下表),PVDF膜需要浸泡甲醇中1-2分钟,再孵育于冰冷的电转缓冲液中5分钟,胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5分钟,否则转膜时会导致条带变形。
注:大蛋白和小蛋白的转膜
电转移缓冲液中SDS与甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度都会影响转膜效果,如下调整可以增加转膜效率:
大蛋白(大于100 KD)
1.对于大蛋白而言,其在凝胶电泳分离迁移较慢,而从凝胶转出也非常慢,因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶,8%或更低,但因低浓度的胶非常易碎,所以操作时需十分小心,
2.大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀,因此;转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为0.1%的SDS,以避免出现这种情况,甲醇易便SDS从蛋白上脱失,因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至10%或更低,以防止蛋白沉淀。
3.降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀,易于大蛋白的转出。
4.如果使用PVDF,甲醇是必需的,且转膜前PVDF需用甲醇活化。但如果是NC膜,甲醇可以不必加入电转移缓冲液中。
5.选择湿式,4 ℃转膜过夜,以取代半干式转膜。
小蛋白(小于100 KD)
1. SDS妨碍蛋白与膜的结合,特别是对小蛋白更是如此,因此,对于小分子的蛋白,电转移缓冲液中可以不加SDS。
2.保持20%的甲醇浓度
对于大于500KD的蛋白,请参考下述文献:Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide, gel electrophoresis. Analytical Biochemistry 247,185–192 (1997).
更多的转膜注意事项:
Ø避免用直接接触膜,应使用镊子,手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑
Ø排列三明治时,尽量用移液器或15ml试管赶除胶与膜之间的气泡,或将三明治放在装有的培养皿中以防止气泡产生,请戴手套!
Ø确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同,否刚导致电流不能通过膜,从而转膜无效
Ø鸡抗体易于与PVDF膜和其它尼龙膜结合,导致高背景,请替换成硝酸纤维素膜以降低背景。
Ø膜上蛋白的检测:丽春红。为检测转膜是否成功,可用丽春红染色,2%的丽春红贮备液(20ML):: 2%丽春红(0.4克)溶于30%三氯乙酸(6克)和30%磺基水杨酸(6克)丽春红染色工作液:2%的丽春红贮备液1:10稀释,即加9 倍的ddH2O染色方法:将膜放入TBST洗一次,再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色5分钟,大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰,(膜也可以用TBST或水重新洗后再进行染色)PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。
9. 膜的封闭
为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景,因此需要进行膜的封闭,
传统上有两种封闭液:脱脂奶粉或BSA,脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白(因脱脂奶粉含有酪蛋白,该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白),使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。
某些抗体用BSA封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号,,请仔细阅读说明书注明的注意事项和膜的特殊的封闭方法。
配制5%脱脂奶粉或BSA 溶液:每100 ml TBST中加入5 g脱脂奶粉或BSA,混匀后过滤,如不过滤会导致使膜污染上细微黑颗粒。
封闭时,4°C摇动,封闭1 hour ,再用TBST洗5秒,进入下一步抗体的孵育。
10. 一抗的孵育
孵育Buffer:按抗体说明书建议的稀释倍数,用TBST稀释一抗,如果说明书没有建议的稀释倍数,则参照一般推荐的稀释倍数(1:100-1:3000),一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。
某些实验室传统上在封闭液中孵育抗体,而有些实验室用不含封闭剂的TBST来孵育抗体,结果因抗体而异,有时两者结果相同,有时结果不同。
注:如果不存在高背景的问题,某些抗体用含低浓度(0.5 – 0.25%)脱脂奶粉或 BSA的封闭液来,稀释,可产生相对更强的信号条带。
孵育时间:一抗的孵育时间可从几小时至过夜(一般不超过18小时)不等,取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的含量丰度,建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。
孵育温度:尽可能低温孵育,如果在封闭液中孵育一抗过夜,应在4oC进行否则会产生污染而破坏蛋白(降别是磷酸基团)。孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆没膜,防止结合不均匀。
11. 二抗的孵育
一抗孵育结束后,用TBST摇动洗膜数次,每次5min或更长,去除残留的一抗。
孵育Buffer和稀释倍数:用TBST按说明书推荐的倍数稀释二抗,如果说明书没有标出稀释倍数,则按常规的倍数稀释(1:1000- 1:20,000)预试,二抗的浓度过高也会导致非特异性条带。亦可以在封闭液中孵育二抗(和一抗),但可能在降低背景同时导致特异性条带的信号也减弱,可能是封闭剂阻碍了抗体与靶蛋白的结合。
孵育时间和温度:室温、1-2 hours, 摇动。
二抗连接物:推荐使用二抗连接HRP,不建议连接AP碱性磷酸酶,因其不够灵敏。
12. 显色
显色分为酶促底物发光和化学发光法或荧光法
酶促底物发光法代表为DAB显色法,与其它同类方法的比较如下图所示:
而现在最常用的是化学发光法:HRP化学发光底物 Luminol(ECL法chemiluminescence)及其改良法,