微卫星不稳定（MSI）的诊断标准：PCR+毛细管电泳和 2B3D 位点是双重金标准

▊ 金标准诊断方法：PCR+毛细管电泳法

目前公认的 检测 MSI 的金标准是 PCR+毛细管电泳法，此方法通过 PCR 同时对同一个体来源的肿瘤组织和正常组织的微卫星位点进行扩增，再借助毛细管电泳对扩增产物进行 DNA 片段分析。比较肿瘤组织和正常组织的基因图谱，如果肿瘤组织的五指峰相较于正常组织发生了位移，则判定该微卫星位点不稳定。

金标准诊断方法对样本的要求为：

1. 同一个患者提供的切片中需要包含肿瘤细胞和正常细胞（对照）；
2. 肿瘤组织切片和正常组织切片数量各 ≥ 5 片（未经 IHC 染色的 FFPE 切片），每片 4-7 μm 厚，切片需要做 H&E 染色，肿瘤组织样本中肿瘤细胞含量不低于 20%；
3. 用于检测的刮片区域需要至少 1 cm²，保存时间不超过 2 年。

▊ 国内外指南共识权威推荐检测位点：2B3D 是通用标准

目前基因组中已知的微卫星位点约为一千九百万个，因此，在 MSI 诊断中，检测位点（Panel）的选择是关键，如果位点选择错误会导致假阳性或者假阴性率增高。1997 年美国癌症中心（NCI）首次基于金标准方法对待检的微卫星位点选择进行了统一，即「NCI Panel」，包括 5 个微卫星位点，由 2 个单核苷酸位点（BAT-25 和 BAT-26）和 3 个双核苷酸位点（D2S123、D5S346 和 D17S250）组成，也被称作「2B3D NCI Panel」。

同时，也统一了该 Panel 的 诊断标准：

• 若这 5 个微卫星位点中有 2 个或 2 个以上的微卫星不稳定，则判定为微卫星高度不稳定（MSI-high，MSI-H）；
• 若有 1 个微卫星不稳定，则判定为微卫星低度不稳定（MSI-low，MSI-L）；
• 若 5 个微卫星位点均稳定，则为微卫星稳定（Microsatellite stable，MSS）。

直至目前，「2B3D NCI Panel」在国际范围内都是最权威的检测标准。《中国临床肿瘤学会（CSCO）结直肠癌诊疗指南 2020 版》、《结直肠癌分子标志物专家共识》（2018 版）、《遗传性结直肠癌临床诊治和家系管理中国专家共识》（2018 版）及《ESMO 共识：肿瘤免疫治疗中的微卫星不稳定检测建议及其与 PD-1/PD-L1 表达和肿瘤突变负荷的关系》（2019 版）等多个国内外指南和共识均明确推荐用「2B3D NCI Panel」进行 MSI 检测。

2002 年，NCI 对 MSI 检测的位点进行了补充，除了可以选择「2B3D NCI Panel」之外，推荐了一个由 5 个单核苷酸微卫星位点组成的 Pentaplex Panel，包括 BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22、NR-24。除了上述两个 Panel，Promega Panel 也常用于 MSI 检测中，它也是由 5 个单核苷酸微卫星位点构成：BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27。

▊ 中国人群中，2B3D 灵敏度高于 Promega Panel

有研究提示在欧美人群中，「2B3D NCI Panel」中的双核苷酸位点导致其敏感性低于单核苷酸位点的 Panel。而 Zheng 等和 Bai 等在两项基于中国人群的多中心研究显示，「2B3D NCI Panel」敏感度高于单核苷酸 Promega Panel，提示「2B3D NCI Panel」更适合中国肿瘤患者。

▊2B3D 较单核苷酸 Panel 多检出 30% MSI-H 肿瘤

近二十年来，国内也有许多 MSI 检测相关的研究，大部分研究使用「2B3D NCI Panel」，另一部分多为 Promega 或其他单核苷酸位点的 Panel。

经过荟萃分析显示，在中国人群中，2B3D 检出的 MSI-H 发生率为 14.2%，而单核苷酸位点 Panel 检出的 MSI-H 发生率为 10.9%，由此，2B3D 较单核苷酸位点 Panel 多检出 30% 的 MSI-H 患者。

▊ MSI 的其他诊断方法

1. 二代测序 NGS：

来源：illumina.com

随着分子生物学的发展和测序成本的降低，二代测序已经成为肿瘤诊疗领域非常重要的一项技术。近年来，全外显子组测序和多基因靶向区域测序逐渐也应用于 MSI 的检测中。2017 年，MSK-IMPACT 和 FoundationOne CDx 是两个获得 FDA 批准用于实体瘤的 NGS Panel 检测分析产品，检测范围均包括对 MSI 的评估。这两个 NGS Panel 与「金标准」方法比较，均有较高的敏感性和特异性。由于 NGS 通量大，灵敏度高的特点，NGS Panel 一次性可检测几个至上千个 MSI 位点、MMR 基因状态及其他分子标志物。《NCCN 结直肠癌临床实践指南》（2020 版）明确指出 MSI 检测可通过经验证的 NGS panel 进行，尤其是对于需要进行 RAS 基因或 BRAF 基因分型的转移性结直肠癌患者。

目前市面上基于 NGS 方法可用于检测 MSI 的 Panel 多为实验室自建试剂（Laboratory developed tests，LDTs），且国内尚无获得国家药品监督管理局 (National Medical Products Administration，NMPA）批准的相应 NGS 试剂盒。目前基于 NGS 方法的 MSI 位点选择鱼龙混杂，需要与金标准方法进行验证确保检测的准确性，再者，由于 NGS 数据分析的复杂性，需要明确统一的算法及评判标准对 MSI 进行评估，而目前国内尚缺乏相关的标准。综上，基于 NGS 的各项优势，该方法后续很有可能成为 MSI 检测的一个重要方法，但目前还需要更多中国人群的数据积累和验证。

2. 免疫组化（IHC）法：

来源：Chao et al., Cancer Commun, 2019

由于 MSI 的状态是由 MMR 功能异常所致，因此 IHC 法可以通过对 MMR 系统中 4 个主要的蛋白（MLH1、MSH2、MSH6 及 PMS2）表达的检测来反映 MSI 的状态，而不是直接对 MSI 进行检测。若肿瘤组织样本中，4 个 MMR 蛋白均阳性表达，则判定为错配修复功能完整（proficient mismatch repair，pMMR），任一 MMR 蛋白表达缺失，则判定为错配修复功能缺失（deficient mismatch repair，dMMR）。

有报道显示，IHC 和金标准 PCR+毛细管电泳法的一致性约在 90% 以上，因此，一般来说，dMMR 相当于 MSI-H 型，pMMR 相当于 MSI-L/MSS 型。但往往在实际的临床工作中，由于检测准确性、肿瘤异质性、判读主观性等问题，IHC 阳性检出的准确率是较低的，有研究显示，IHC 检出的阳性（dMMR）患者中的准确率仅为 43.68%。

569 例结直肠癌样本 IHC 和 PCR (金标准方法) 比较

来源：Chen et al., Int J Clin Exp Pathol, 2018

基于 IHC 方法成本低，耗时少的优点，在国内的医疗单位中普及性强，IHC 法检测 MMR 蛋白表达可在多数医院的病理科完成，同时可以明确 MMR 中存在功能缺陷的基因。但 IHC 判读识别 dMMR 对病理医师要求较高，检测结果在很大程度上受判读人员的主观因素影响，存在一定概率的假阴性和假阳性。另一方面，IHC 检测的一抗选择对阳性和阴性的判断至关重要，操作流程难以标准化和规范化，无法保证 IHC 结果的可重复性，从而大大影响检测结果的判读，因此选择高质量的抗体对结果判读至关重要。

MSI 三种诊断方法的比较：金标准 vs IHC vs NGS

参考文献：

1. Boland, C.R., et al., A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for Cancer Detection and Familial Predisposition: Development of International Criteria for the Determination of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Cancer research, 1997. 58: p. 5248-5257.
2. Umar, A., et al., Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome) and microsatellite instability. J Natl Cancer Inst, 2004. 96(4): p. 261-8.
3. Vilar, E. and S.B. Gruber, Microsatellite instability in colorectal cancer-the stable evidence. Nat Rev Clin Oncol, 2010. 7(3): p. 153-62.
4. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines^®) Colon Cancer 2019 Version 4. 2019.
5. Dudley, J.C., et al., Microsatellite Instability as a Biomarker for PD-1 Blockade. Clin Cancer Res, 2016. 22(4): p. 813-20.
6. Zheng, J., et al., The clinicopathological features and prognosis of tumor MSI in East Asian colorectal cancer patients using NCI panel. Future Oncol, 2018. 14(14): p. 1355-1364.
7. Bai, W., et al., Screening of MSI detection loci and their heterogeneity in East Asian colorectal cancer patients. Cancer Med, 2019. 8(5): p. 2157-2166.

编辑： z翟某某