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植物外泌体-下一代生物治疗技术新星？

植物外泌体-下一代生物治疗技术新星？

2025-01-03 16:08点击次数：1857

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植物外泌体样纳米囊泡（plant exosome-like nanovesicles, PELNs）是源于植物真核细胞的多泡体，通过后者与质膜融合释放到细胞外的一种膜性小囊泡。PELNs往往富含各种具有生物活性的脂质、蛋白质、RNA等成分，是天然的纳米制剂，被证明在肿瘤、免疫调节、肠道疾病与再生医学等方面具有显著的调控作用。

目前植物主要分为水果、蔬菜和草药三类，每组的PELNs都可以应用于生物医学。水果来源的PELNs表现出抗氧化能力，蔬菜来源的PELNs表现出抗病毒和胰岛素抵抗调节能力，草药来源的PELNs具有再生和抗骨质疏松症的作用。而且随着纳米科学的进步，人们越来越关注外泌体在可食用植物中的存在和作用。来自植物的 miRNA 可能对不同物种产生生物学效应。值得注意的是，在PELNs中检测到大量 miRNA，这些 miRNA 被人体吸收并发挥治疗作用，PELNs可能作为植物将 miRNA 转移给动物的途径。此外，PELNs 因其卓越的生物相容性、稳定性以及在各种治疗应用中递送亲水和疏水能力而被用作药物递送载体，例如肿瘤靶向递送、结肠靶向递送、透皮递送和基因递送。

研究发现，植物外泌体蕴含了植物中90%的活性成分，是植物有效成分浓缩的精华中的精华。1kg植物仅能提取1μg植物外泌体，而其活性却远高于1kg植物提取物。目前，公开报道的植物外泌体研究包括生姜外泌体、人参外泌体、金银花外泌体、姜黄外泌体、葡萄柚外泌体、大蒜外泌体等。

图1. 植物外泌体功效

一、植物外泌体提取方法

目前，市面上提取外泌体的方法有很多，但各有优劣，还没有哪一种可以同时兼顾外泌体的得率和纯度。而植物外泌体不同样本的组织特异性大，选择一个合适的提取方法就显得更加困难，金开瑞生物通过不断改进植物组织样本的前处理方法，并结合超速离心技术，目前已经成功提取了几百种植物外泌体，接下来以雪梨分离外泌体为例，给大家详细介绍如何提取外泌体。

01.组织预处理

1. 取雪梨样本，用纯水洗净，称重50g，加入150~200ml PBS（按重量1：3比例加入），在冰箱4℃浸泡24h，然后用榨汁机榨汁；

2. 用医用纱布过滤汁液；

3. 汁液中加入5g果胶酶处理，于摇床中放置约18h去除胶质

4. 1000 g，离心10min，弃沉淀，取上清；

5. 3000 g，离心30min，弃沉淀，取上清；

6. 12000*g，4℃，离心30min，弃沉淀，取上清；

7. 用0.45 μm滤膜过滤上清液。

02.超速离心提取雪梨外泌体

1. 4 ℃ 10 0000 ×g 离心1 h，除去上清液；

2. 加20 mL PBS重悬沉淀，4 ℃ 10 0000 ×g 离心1 h，除去上清液；

3. 加适量PBS（1.0 mL）重悬沉淀，收集外泌体。

4. 用0.22 μm滤头过滤除杂除菌，用少量PBS冲洗滤膜残留的外泌体，随后于-20 ℃保存用于后续检测。

图2. PELNs 的提取及鉴定（A和B 来源于[1]）

二、生物活性

最近在Theranostics杂志上发表了一篇综述，名为《Exosome-like nanoparticles derived from fruits, vegetables, and herbs: innovative strategies of therapeutic and drug delivery》，这篇文章综述了PELNs的制备方法及其在预防各种疾病和药物传递中的多样化作用。

01.抗炎

♦调节巨噬细胞：巨噬细胞是许多慢性炎症和自身免疫性疾病发病机制的关键参与者，例如，葛根 PELNs通过下调促炎基因的表达来促进 M1巨噬细胞向 M2表型的极化。此外，大蒜来源的 PELNs 中的 miR-396e 调节 PFKFB3 的表达，影响巨噬细胞的代谢重编程，并通过巨噬细胞和脂肪细胞之间的串扰减轻肥胖小鼠脂肪细胞的炎症。

♦肠道炎症治疗：口服 PELNs 对肠道炎症表现出显著的治疗效果，口服葡萄和橙子 PELNs 可促进葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠粘膜上皮再生和整个肠道结构的快速恢复。在源自芹菜、马铃薯、马铃薯和苦瓜的 PELNs 中也观察到了类似的效果。

♦缓解炎症：含有大蒜衍生的 PELNs 与小胶质细胞中的 BASP1 相互作用，抑制 c-Myc 介导的 STING 表达并降低炎性细胞因子的表达，从而减少高脂饮食诱导的炎症。燕麦麸衍生的 PELNs 通过调节 HPCA/Rab11a/dectin-1 复合物的组装来改善酒精诱导的脑炎症。这些发现证实，饮食衍生因子有可能通过其抗炎作用影响大脑健康。

02.抗肿瘤活性

目前已经证实各种植物来源的外泌体具有抗肿瘤作用，包括促进细胞凋亡、细胞周期停滞、抑制细胞增殖、诱导线粒体损伤和抑制上皮间充质转化。

例如，柠檬 PELNs 诱导 ROS 生成，上调 GADD45α 表达，导致细胞周期停滞在 S 期，并诱导胃癌细胞凋亡。

玉米的 PELNs 已被证明可刺激 Raw264.7 细胞释放炎症因子，从而抑制小鼠的结肠细胞增殖和抑制皮下结肠肿瘤生长。

人参衍生的 PELNs 可以促进细胞凋亡增加，从而减缓肿瘤进展，还可以通过调节肿瘤相关巨噬细胞（TAM），对“冷”和“热”肿瘤具有治疗作用。

03.肠道微菌群调控

肠道微生物群是肠道微生态系统的重要组成部分，其动态平衡在身体的生理功能中发挥着关键作用，PELNs可以调节肠道微生物群的丰度，从而维持肠道稳态。

大蒜来源的 PELNs 中的p-miR2916-p3 特异性促进多形拟杆菌的生长，从而抑制 DSS 诱导的结肠炎。

地黄 PELNs 中的 Rgl-miR-7972 通过靶向毒力基因 sxt2 抑制大肠杆菌生物膜的形成，从而减轻 LPS 诱导的肺部炎症并恢复肠道菌群失调。

马齿苋 PELNs 可以调节肠道微生物群丰度，从而改善肠肺轴水平的肠道和肺部炎症。

生姜 PELNs 通过选择性调节肠道微生物群内的 mRNA 和蛋白质，在减轻肠道炎症方面表现出有前途的能力。据报道，生姜 PELNs 中的 mdo-miR7267-3p 以脂质依赖性方式有效地靶向 LGG 的单加氧酶 ycnE。这种靶向相互作用随后激活抗菌免疫并促进粘膜表面的组织修复，从而改善 DSS 诱导的结肠炎小鼠模型中的肠道屏障功能。

因此，PELNs 中存在的 miRNA 可能在调节肠道微生物群的组成中发挥关键作用。

04.抗氧化活性

在水果来源的 PELNs 中发现了多种抗氧化化合物，例如抗坏血酸、过氧化氢酶、花青素和谷胱甘肽，这可能是它们独特的抗氧化活性的原因。研究报告显示从芦笋、葡萄、猕猴桃、樱桃、血橙、橙子、番茄、木瓜、葡萄柚、柠檬、芒果和佛手柑的果汁混合物中提取的 PELNs 显著降低了H₂O₂诱导的氧化应激小鼠的 ROS 和丙二醛（MDA）水平。口服石榴 PELNs 可降低肝脏氧化应激，防止肠道渗漏，从而表明它们具有作为肝脏或肠道保护抗氧化剂的潜力。值得注意的是，蓝莓 PELNs中存在的 miRNA 还具有抗炎和抗氧化特性，这意味着抗氧化作用可能不仅仅来自次生代谢物。

05.抗病毒活性

每到冬季，各种病毒肆虐，威胁人类的生命健康，一些植物来源的外泌体展现出较好的抗病毒的效果，为有效抑制病毒提供了全新的思路。生姜因其在医学和烹饪应用中的双重作用而得到认可，通过生姜衍生的 PELNs中包含的 miRNA 靶向 SARS-CoV-2 病毒的 RNA，已显示出巨大的潜力。金银花提取的外泌体miRNA可通过饮用被人体吸收，并在体内有效抑制新冠病毒复制，加速患者转阴性。

06.草药衍生 PELNs 的再生作用

草药自古以来就被用于治疗疾病，但草药衍生的 PELNs作为新型纳米衍生物，与草药相比可能具有不同的成分和机制，因此需要进一步研究。草药衍生的 PELNs通过促进皮肤愈合、刺激神经再生和增强血管生成来展示再生特性。人参和小麦 PELNs可以通过增强内皮细胞的迁移和促进血管生成来促进伤口愈合。蒲公英衍生的 PELNs可以中和金黄色_葡萄球菌产生的外毒素，当掺入明胶甲基丙烯酰水凝胶中时，这些 PELNs会持续释放，促进被金黄色_葡萄球菌外毒素感染的伤口的愈合过程，这些发现表明在皮肤伤口治疗中的潜在应用。此外，人参衍生的 PELNs可促进神经分化，同时通过促进神经营养因子和影响 Ras/Erk 通路来增强神经再生。

三、植物外泌体作为药载

合成纳米颗粒，如脂质体，是目前药物递送的载体，最近的研究表明，PELNs与合成纳米颗粒类似，具有先天的药物递送能力。PELNs 和脂质体具有共同的基本特征，包括脂质双层结构，能够同时递送亲水性和疏水性药物。然而，与脂质体相比，PELNs 具有几个关键优势：

（1）合成脂质体可能会诱导细胞应激等不利影响，而 PELNs 表现出更高的生物相容性和更低的毒性，如：静脉注射同等剂量的葡萄柚 PELNs 和 DOPE 脂质体仅会导致脂质体的肝功能损害。

（2）与仅用作药物载体的合成纳米颗粒不同，PELNs由于其天然结构而具有固有的治疗特性。

（3）PELNs表现出较强的细胞摄取，最近的一项研究报告称，PELNs的内化率超过 80%，而脂质体的内化率为 40%。

总之，PELNs在多个关键领域比传统脂质体具有显着优势，从而为未来的疾病治疗提供了新的途径。

表1：PELNs 在药物递送中的应用总结

文章：Biomimetic Grapefruit-Derived Extracellular Vesicles for Safe and Targeted Delivery of Sodium Thiosulfate against Vascular Calcification

发表期刊ACS Nano IF: 15.8

作者开发了一种仿生纳米载体，将临床批准的药物硫代硫酸钠（STS）加载到葡萄柚衍生的 EV 中，并进一步用羟基磷灰石晶体结合肽修饰（ESTP）。使用生物仿生葡萄柚衍生的EVs递送硫代硫酸钠，能够显著提升其在体内的生物利用度，并增强其抗血管钙化的效果，EVs的递送机制可能涉及与靶细胞膜的相互作用，通过内吞作用将药物释放到细胞内，从而提高药物的疗效。这项工作为纳米药物提供了一种特殊的递送系统，这很有可能在临床上转化为血管钙化疾病的治疗方法，无需担心全身毒性。

植物仿生细胞外囊泡的优势:

♦递送载体：葡萄柚衍生的细胞外囊泡（EVs）不仅能作为药物递送的载体，还能发挥显著的抗血管钙化的功能。它们能够改善药物的稳定性和生物利用度，从而增强治疗效果。

♦靶向性：细胞外囊泡可以通过细胞膜的自然融合机制，靶向特定细胞和组织。这种靶向递送的特性使得药物能够更有效地作用于病灶，而不会对健康组织造成过多损害。

♦生物相容性：葡萄柚衍生的EVs具有良好的生物相容性，能够减少免疫反应，为药物提供一个安全的递送平台。

图3. 抑制血管钙化的 ESTP 示意图[2]

（a）葡萄柚衍生的细胞外囊泡（EV）纳米药物（标记为与 ESTP）一起制备的，方法是通过将硫代硫酸钠（STS）加载到 EV，然后修饰羟基磷灰石结合肽 SP5–52-SH （TP）涂覆到 EV 表面，使用 DSPE-（PEG）2000-马来酰亚胺作为连接剂。

（b）全身给药后，ESTP 纳米药物积极积累在 TP的帮助下在血管钙化（VC）部位，其中不仅释放 STS，还释放天然生物活性化合物的 EV通过驱动 M2巨噬细胞极化有效减轻炎症和抑制血管的成骨表型反式分化平滑肌细胞（VSMC）。天然葡萄柚衍生物的协同作用 EV、临床批准的药物 STS 和 TP 可产生有效的抗 VC 疗效，副作用轻。

四、植物外泌体靶向性改造

植物外泌体具有物质运输和信号传递的功能，通过对其进行靶向性改造，可以使其更精确地定位到特定的细胞或组织，这种精确性在疾病治疗、预防检测以及免疫系统调节等方面具有重要作用。在癌症治疗中，靶向性改造后的植物外泌体可以携带抗癌药物或免疫调节因子，直接作用于癌细胞或免疫细胞，从而提高治疗效果并减少副作用。除此之外，靶向性改造后还可以进一步增强其穿透性，使其能够到达传统药物难以触及的部位，这对于治疗脑部疾病、神经系统疾病等具有重要意义。

浙江大学彭丽华团队在纳米领域高影响力期刊Nano Today发表了题为“Plant-derived exosomes as cell homogeneous nanoplatforms for brain biomacromolecules delivery ameliorate mitochondrial dysfunction against Parkinson’s disease”的研究论文。

文章亮点：

♦率先制备并建立植物中药葛根外泌体囊泡的精准质控标准；证明经修饰改造后的葛根外泌体能够经鼻腔给药向脑区有效递送中药活性miRNAs并发挥抗帕金森病（PD）的体内外治疗作用；

♦首次揭示葛根外泌体介导的中药miRNAs抗PD的分子机制，与其调控PINK1-Parkin介导的线粒体自噬清除功能，并通过保留线粒体呼吸链复合物 I 和 V 的活性来恢复 ATP 补充，从而全面改善 SH-SY5Y 细胞的线粒体功能障碍；为基于工程化植物中药外泌体介导中药活性miRNAs经鼻脑靶向递送治疗脑部疾病提供了全新思路与技术借鉴，也为相关领域的交叉研究开辟了新途径，提供了新思路；

♦植物中药外泌体具有出色的生物相容性、低免疫原性，与生物屏障穿透力，在此基础上对中药外泌体进行工程化改造，使其有望成为新一代高效安全的中药纳米制剂，未来发展前景广阔。

图4. 工程化葛根外泌体囊泡经鼻脑靶向递送活性miRNAs抗帕金森症的效能与机制[3]

金开瑞植物类外泌体提取

我司在外泌体领域深耕多年，尤其在植物外泌体课题研究上具有丰富的经验，可以提供外泌体提取、鉴定、示踪、药物装载、转录组、蛋白组、代谢组学、细胞功能实验，动物实验验证等相关服务，全方位满足您的科研需求，期待与您携手合作，共同推动外泌体行业的发展。

参考文献：

[1]Zhao B, Lin H, Jiang X, Li W, Gao Y, Li M, Yu Y, Chen N, Gao J. Exosome-like nanoparticles derived from fruits, vegetables, and herbs: innovative strategies of therapeutic and drug delivery. Theranostics. 2024 Aug 1;14(12):4598-4621. doi: 10.7150/thno.97096.

[2]Feng W, Teng Y, Zhong Q, Zhang Y, Zhang J, Zhao P, Chen G, Wang C, Liang XJ, Ou C. Biomimetic Grapefruit-Derived Extracellular Vesicles for Safe and Targeted Delivery of Sodium Thiosulfate against Vascular Calcification. ACS Nano. 2023 Dec 26;17(24):24773-24789. doi: 10.1021/acsnano.3c05261.

[3]Yang Xu, Ge Yan, Jingyu Zhao, Yunhao Ren, Qiyao Xiao, Minhong Tan, Lihua Peng,Plant-derived exosomes as cell homogeneous nanoplatforms for brain biomacromolecules delivery ameliorate mitochondrial dysfunction against Parkinson’s disease,Nano Today,Volume 58,2024,ISSN 1748-0132,doi.org/10.1016/j.nantod.2024.102438.