【推荐】分子诊断技术在抗生素耐药性检测中的应用与未来

目前，向全球卫生监督系统报告的数据是基于表型抗药性的检测，即在抗菌剂存在的情况下检测细菌的生长情况。这些方法可以通过测量最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration ，MIC)或盘扩散试验中的区域直径，确定分离出的病原体对特定抗菌剂的耐药程度。

这些方法可为临床管理和监测提供信息，但不能直接提供有关病原体耐药性机制的信息。检测表型耐药性的方法通常需要很长时间(最快几小时，最慢几天)。因此，值得考虑用AMR分子诊断来补充这些方法，以确认和跟踪抗药性机制 。

相比之下，分子AMR诊断测试用于检测细菌病原体基因组中已获得的基因或突变，这些基因或突变使它们对给定类别的一个或多个抗菌药物具有耐药性（即检测与耐药机制相关的基因）。

分子和表型抗菌药物耐药性诊断相辅相成，可以提高对给定环境中耐药性程度及其底层机制的理解。

市场上有各种分子检测方法，用于检测特定的抗药性基因，既可用于临床，也可用于监测。

例如：

在临床环境中，对疑似耐甲氧西林金黄色*葡萄球菌（MRSA）分离物可通过检测mecA 和mecC（对β-内酰胺酶稳定青霉素耐药的编码基因）来确认。

如果发现大肠杆菌或肺炎双球菌对第三代头孢菌素产生耐药性，可通过检测不同的广谱β-内酰胺酶（ESBLs）来确定产生耐药性的基因。

许多产品可用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶基因。

耐药性基因的特征为更好地了解AMR分子流行病学提供了重要信息。

在常规临床环境中，检测的结果时间（TTR）更为重要，而在监测环境中，高通量检测可能更有优势。

图1标出了适用于临床和监测环境的检验类型(临床用工作人员符号表示，监测用微生物符号表示)。哪种检测适合哪种实验室类型，取决于检验的复杂程度和成本，以及实验室的经验、预算、基础设施和AMR监测目标。

低复杂度和低成本的检测可能适合大多数类型的实验室，而高复杂度和高成本的检测可能只适合有足够预算的成熟国家实验室。

图1. 不同AMR技术在成本&复杂性上对比 （源自WHO信息）

截止2019年WHO发现了62种分子AMR诊断检测¹，用于检测GLASS列出的优先病原体(某些测试合并在更大的测试面板中)相关的耐药标记(基因或突变)。

目前，大多数经过验证的分子AMR诊断测试可归类为以下四类：扩增、测序、杂交、或免疫检测。

▶扩增：扩增目标基因序列的拷贝数以便检测

▶测序：通过分析基因组序列来检测耐药基因

▶杂交：核酸探针与靶基因序列杂交实现检测

▶免疫检测：基于抗体与靶基因或其产物结合来实现检测。

图2. 不同分子AMR检测技术对比

分子AMR诊断方法的复杂性可以根据样本处理方式、检测技术及设备要求分为低中高三等。低复杂性检测不需要或只需要很少的分子实验室经验。高复杂性检测需要大量的实验室能力和经验。

分子AMR诊断测试的成本取决于测试的复杂性、所需的设备以及所在国家或地区，因为实验室设备和试剂通常由专业供应商分销，这些供应商通常独立于制造商建议的价格制定价格。这导致了一个矛盾的情况，即低收入国家可能会为相同的设备和测试支付比高收入国家更高的价格。当前依赖供应商的定价策略是广泛实施分子AMR监测的主要障碍。

根据病原体，分子AMR检测主要是针对：耐药性肺炎链球菌 (DRSP)、耐药性弯曲杆菌 (DRC)、艰难梭菌 (CD)、耐甲氧西林金黄色*葡萄球菌 (MRSA)、耐药性淋病奈瑟菌 (DRNG)、耐药性沙门氏菌 (DRNTS) 等。

2021 年，耐甲氧西林金黄色*葡萄球菌 (MRSA) 检测在AMR诊断市场中占据最高份额，主要原因是医院环境中MRSA 流行率不断上升。

近年来，分子AMR检测技术取得了显著进展，具体包括：

1. 快速诊断：新型分子诊断工具可以在数小时内提供结果，大大缩短了检测时间。

2. 便携式设备：便携式PCR和NGS设备的开发使得现场检测成为可能，尤其适用于资源有限的地区。

3. 多重检测：技术的进步使得同时检测多种耐药基因成为现实，提高了检测的全面性和效率。

4. 自动化平台：全自动化检测平台减少了人工操作的误差，提高了检测的标准化和重复性。

分子AMR检测在北美诊断市场中占据了较大的份额，基本头部的诊断企业都在这个领域通过收购、合资、兼并或合作进行了产品布局：

图3. AMR诊断检测主要企业及市场占有分析（源自researchandmarket信息）

虽然分子检测提供了重要的临床相关信息，但它们也有局限性，而且分子检测只能检测已知的耐药性基因或突变，表型耐药性检测在监测中始终是必要的，以确保对细菌分离物进行正确分类。其他挑战包括：

1. 成本高：某些分子检测技术的成本较高，限制了其在资源有限地区的普及。

2. 复杂性：高通量测序等技术的数据分析复杂，需要专业的生物信息学支持。

3. 未知耐药基因：现有检测方法主要针对已知耐药基因，对于新型或未知耐药基因的检测仍有局限。

4. 标准化及质控问题：不同实验室之间的检测标准和方法可能存在差异，影响结果的可比性。对选定病原体进行经质量保证的标准化测试的原理性研究是必要的，以用于监测目的。这将减少（但不消除）外部质量评估和哨站点之间测试结果比较中可变性试验性能的混淆效应。

为了正确监测治疗方案和识别AMR，迫切需要快速而直接的检测技术，重点是现场微生物检查，并具有足够的灵敏度和特异性。

需要在实验室进行的AMR检测增加了治疗费用。为了缩小治疗和诊断之间的差距，在WHO发布的GLASS计划中强调了“有效、快速、低成本的诊断技术在指导人类和动物医学中适当使用抗生素”的重要性和必要性。该行动计划旨在通过快速、准确且成本最低的POC检测诊断技术提高诊断的速度和准确性。

POC诊断可以在床边以高检出率正确检测抗菌药物耐药性病原体，从而可以快速启动适当的治疗，同时避免抗生素的过度使用或滥用。

此外，POC设备可以缓解传统检测方法的一些困难。POC检测方法利用尿液样本、血液或口腔液体在床边或医生办公室进行AMR检测，提供了针对疾病的、便携的、易于使用的检测，无需或只需一点培训即可。

开发能够提供指定输出特性的创新、小型且经济高效的 POC AMR分子检测能拓宽临床应用并改善治疗效果。因此，预计开发用于检测AMR的POC检测和设备将成为近十年内富有成果的研究领域。

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