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ATAC-seq及CUT&Tag技术,是目前炙手可热的表观遗传学研究技术,在文章中用好这些技术,可以使文章增色不少,但目前还有很多科研人都未接触过相关技术,因此让我们来详细了解一下这两个好用的明星技术。 首先,我们从常见的表观遗传研究「套路」入手,来看看这些技术是怎样运用的: 图1 表观遗传研究常见思路示意图
ATAC-seq技术: ATAC-seq技术,即染色质可及性检测技术,在真核生物细胞中,DNA与组蛋白结合形成核小体,核小体再进一步折叠压缩形成染色质,在DNA复制或转录时,染色质紧密结构被打开,称为开放染色质(Open Chromatin);未开放区域为封闭染色质(Closed Chromatin)。同时,开放区允许反式作用因子与启动子、增强子、绝缘子、沉默子等顺式调控元件相结合。这种允许调控因子结合的特性称为染色质的可及性。ATAC-seq则是利用Tn5转座酶结合高通量测序技术,来研究染色质可接近性,即ATAC-seq。 ATAC-seq技术工作原理:ATAC-seq技术的核心是孵育有测序接头的Tn5酶。在进行ATAC-seq实验时,首先提取细胞核,然后孵育连有接头的Tn5酶。随后Tn5酶对染色质开放区进行打断,在打断的同时加上测序接头,接着进行DNA提取,PCR扩增构建文库。经过测序分析,推断染色质可行性、转录因子结合位点、组蛋白修饰区域和核小体位置。 图2 ATAC-Seq实验流程示意图 1.裂胞 裂解细胞,制取细胞核。高灵敏度ATAC-seq实验方案2.0(近岸蛋白产品目录号:N248)最低兼容500个细胞进行实验,且提供常用的基础细胞裂解液,适用于人源、鼠源的细胞系;同时,对于其他非实验室培养细胞系的裂解,也可参照相关文献,在基础细胞裂解液中添加相应的成分从而达到更好的裂解效果。高质量的细胞核是实验成功的基础,也是染色质开放性实验最关键的步骤。 2.片段化 打断基因组,获取目的片段。此模块需包含一个孵育测序接头的转座酶,近岸蛋白ATAC-seq实验方案2.0内含特殊优化的转座体,灵敏度更高,可实现500-50,000个细胞建库,下机数据分布清晰、信噪比高、特异性强。 图3 染色质开放性检测试验结果 片段化之后,可以选择性的进行DNA提取。近岸蛋白Tagment DNA Extract Beads(DNA提取磁珠,目录号:N245),该磁珠能够完整的保留40-100bp的小片段。 图4 磁珠回收片段分布结果 将提取产物PCR扩增,选择无偏好性扩增酶扩增酶,能够更好地地完成文库扩增,获得更优质的结果。
图5 文库结构示意图
5.文库纯化扩增后的文库可直接使用近岸蛋白NovoNGS® DNA Clean Beads(目录号:N240)纯化,纯化后的产物可直接用于二代测序。 近岸蛋白ATAC-seq实验方案2.0(目录号:N248),提供ATAC-seq实验所需试剂及磁珠,一盒解决您的染色质开放区研究实验需求! 在使用ATAC-seq染色质开放性检测后,寻找到潜在TF后,则需要使用CUT&Tag技术进一步探究潜在TF的具体作用。 CUT&Tag技术: CUT&Tag是一种蛋白质-DNA互作关系研究的新方法,与以往的ChIP-Seq、pA-MNase等方法相比,该技术方法简便易行,信噪比高,重复性好,所需细胞少,仅需60个细胞,且有望做到单细胞水平。 图6 CUT&Tag实验流程示意图 接下来,我们详细解析一下CUT&Tag技术。 1.细胞悬液制备/细胞核制备 实验室常规培养细胞制成细胞悬液即可,尽量减少细胞聚团情况;组织样本、冷冻组织样本则建议使用裂胞试剂获取细胞核,单次实验≥60细胞即可实验,实验细胞量远远低于其他实验。 2.细胞/细胞核与磁珠结合 使用表面耦连刀豆蛋白的磁珠,从细胞悬液中富集细胞或细胞核,使后续实验可视化。 3.一抗、二抗孵育 选择研究位点对应的一抗抗体进行实验,同时选择与一抗同源的无修饰的二抗,如:一抗使用H3K4me3的兔抗,则二抗选择无修饰的羊抗兔二抗抗体。 选择ChIP或IP实验验证的一抗抗体可有效提高成功率;一抗用于靶点定位,二抗用于放大一抗信号,使后续转座酶切割更精准。 4.转座体孵育与片段化 将转座体加入样本中,并加入含有Mg2+的缓冲液,激活转座体进行片段化。 5.DNA回收及PCR扩增 使用提取磁珠回收片段化的DNA,纯化,再进行PCR扩增,即可用于二代测序。 数据展示 :
图7 使用近岸蛋白CUT&Tag试剂盒对100~100K数量的人源K562细胞进行H3K4me3抗体的CUT&Tag实验,结果如图所示。
CUT&Tag技术具有实验操作简便,下机数据信噪比高等优点,已经成为了替代ChIP-seq、pA-MNase技术的优选技术,特别是在组蛋白修饰及结合力强的转录因子研究中,但针对一些高动态性、结合力较弱的DNA结合蛋白,则难以获得理想的结果,近岸蛋白采用高浓度甲醛交联固定的方法,创新推出CUT&Tag® 4.0试剂盒,使弱结合力蛋白也能够获得较好的下机数据,信噪比高,重复性好。近岸蛋白CUT&Tag® 4.0试剂盒甲醛交联数据展示: 图8 CUT&Tag4.0 交联与非交联TSS结果 图9 CUT&Tag4.0 交联与非交联IGV视图结果 近岸蛋白CUT&Tag® 4.0试剂盒(目录号:N259-YH01),拥有针对弱结合力蛋白高效的甲醛交联方案,同时也拥有传统CUT&Tag实验方案,一盒两套方案及试剂,不论转录因子、辅因子还是组蛋白修饰等研究,都能够轻松hold住! 总结:ATAC-seq是一种高效探索染色质开放区的技术,其以简便高效,重复性好等优点,已成为研究染色质开放性优选的技术方法;而CUT&Tag技术是一种蛋白质-DNA互作的研究方法,具有操作简便,下机数据信噪比高、重复性好等特点,两种技术均较前代技术在实验操作及结果可靠性有着明显的提升,成为了相关实验中的优选技术。并且,通过ATAC-seq、CUT&Tag和RNA-seq等多组学方案进行研究也可为文章增色不少,高分文章、国自然申请,也能马到成功! |