CRISPR技术自问世以来,以其操作的便捷性,高效的基因编辑能力获得青睐,发展成为一种有效的分子生物学工具,不仅大大加速了基础科学的研究进程,也带来了许多疾病诊断和治疗的创新方法,是当下科学家的新宠儿。CRISPR文库筛选是以CRISPR基因编辑技术为基础,通过在基因组层面上干扰基因功能来筛选目的表型,是剖析基因功能、探索生物进程和疾病的重要工具。CRISPR文库筛选在耐药基因筛选,病毒感染靶基因筛选,癌症相关基因筛选,信号通路参与基因等功能基因研究进展中发挥了重要作用。
耐药基因筛选 运用CRISPR文库筛选技术可以系统的分析、验证一些与抗药性相关的基因,从而为疾病治疗提供相关数据。Imatinib是一种治疗白血病及胃肠道间质肿瘤的药物,通常使用后会产生耐药,且机制不明。科学家运用CRISPR全基因敲除文库在胃间质瘤中筛选并验证了 TP53, SOCS6,DBP, NR3C1, TCF12, ZNF12, ZFP36, ACYP1和DRD1这9个可能参与Imatinib耐药的基因,为深入探讨Imatinib耐药的分子机制提供了重要依据。
Vemurafenib是突变的蛋白激酶BRAF的抑制剂,被批准用于晚期黑色素瘤的治疗,对存在V600E BRAF突变的黑色素瘤有治疗效果,但患者持续服用会产生耐药。为了研究耐药机制,科学家利用慢病毒载体将设计好的CRISPR全基因组文库转染进有V600E BRAF突变的黑色素瘤细胞A375中,再加入Vemurafenib抑制A375细胞生长,从而富集少数具有Vemurafenib药物抗性的细胞。通过对这部分细胞的sgRNA序列进行分析,筛选出了与Vemurafenib耐药性有关的nf1、med12、nf2、cul3、tada2b和tada1等基因,发现这些基因敲除后能够使细胞对Vemurafenib产生抗性,为Vemurafenib肿瘤耐药机制提供了新发现。
阿糖胞苷(Cytarabine, Ara-C)是一种治疗AML的药物,患者使用后往往出现机制不明的耐药。科学家利用CRISPR文库筛选出针对AML的阿糖胞苷耐药RNA。发现了lncRNA GAS6-AS2的激活会介导耐药的产生,并通过体内、外实验验证这一发现。 CRISPRa Functional Screening of Noncoding Genes Modulating Ara-C Response1
病毒感染靶基因筛选 许多疾病都与病毒感染相关,筛选出病毒受体或病毒在宿主细胞中复制关键基因有助于开发新的传染病预防及治疗策略。HIV引发的艾滋病严重威胁着人类生命健康,阐明HIV突破宿主细胞防御系统的分子机制,开发HIV治疗的新靶点,进而提出新的HIV防治策略,具有非常重大的理论意义和实际应用价值。科学家利用全基因组CRISPR文库筛选影响HIV感染的宿主因子的研究中,鉴定出包括HIV感染所需的受体CD4和CCR5,促进HIV包膜识别CCR5的酪蛋白磺基转移酶2 (Tyrosylprotein sulfotransferase 2,TPST2)和溶质家族35成员B2 (Solute carrier family 35 member B2,SLC35B2)及介导细胞间HIV传播所需的白细胞粘附因子(Activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM),这5个基因被敲除后均不影响T细胞的存活,但能够使T细胞抵抗HIV的感染,因此可以作为HIV治疗的潜在靶标,为预防和治疗艾滋病提供新的理念和途径。EBV感染宿主B淋巴细胞后,可使其恶变转化为伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma, BL) 和淋巴母细胞系(lymphoblastoid cell lines,LCLs)等,在其恶变转化过程中,EBV致病基因亚型和宿主依赖基因如何发挥作用目前仍不明确。科学家利用CRISPR文库筛选技术,对EBV感染阳性、B细胞发生恶变转化的BL和LCLs基因组进行基因亚型筛选,分别检测出与肿瘤细胞生长和存活至关重要的57个BL基因和87个LCLs基因;进一步通过基因功能缺失对比研究证实,EBV潜伏膜蛋白LMP-1诱导的cflip是LCLs抵御TNF-α介导的程序性细胞死亡的关键因子;EBV诱导激活的batf/irf4是LCLs中抑癌基因bim抑制和癌基因myc激活的决定因素。因此借助CRISPR全基因文库筛选技术,有助于发现及分析EBV相关BL和LCLs的关键致病基因亚型和宿主依赖基因,从而加深对EBV致病机理的认识。
CRISRP/Cas9 Screens Identify Growth and Survival Factors in EBV-infected Burkitt and Lymphoblastoid B-cells2
肿瘤是机体受到遗传及环境等多重因素影响,致癌基因和抑癌基因发生突变而导致的细胞生长不受调控。利用CRISPR-Cas9全基因组文库筛选方法可广泛用于肿瘤细胞的生长和侵袭过程的研究,对于控制癌症细胞生长和抑制癌症侵袭具有一定的研究意义,也为癌症治疗药物的靶点筛选提供了新方法。在非小细胞肺癌的研究中,科学家利用CRISPR-Cas9文库对小鼠体内全基因组筛选后,发现NF2、PTEN、CDKN2A、TRIM72、FGA、miR-345及miR-152基因能够促进非小细胞肺癌细胞侵袭,同时这些基因也与原发性肿瘤的生长和侵袭成正相关。
在胰腺癌的研究中,科学家将靶向全基因组sgRNA文库导入RNF43突变的胰腺导管腺癌细胞(PDAC) HPAF-Ⅱ,通过对不同时间点细胞的sgRNA的丰度变化进行分析从而鉴别影响细胞增殖的基因,鉴定出2174个影响HPAF-Ⅱ细胞增殖的基因,其中参与Wnt信号通路的FZD5,对PDAC的增殖具有重要的意义。
Genome-wide CRISPR–Cas9 screens identify genetic vulnerabilities of RNF43-mutant PDAC cells3
细胞信号通路基因筛选 细胞各种生理活动均受到信号通路的调控,许多经典的信号通路及其参与基因已经被广泛研究与报道,还有许多信号通路的关键参与基因尚待阐明。细胞焦亡是机体在感知病原微生物浸染后启动的免疫防御反应,早期发现炎症激活的caspase-1和识别细菌脂多糖的caspase-4、caspase-5和caspase-11在细胞焦亡的信号通路中起到重要作用,这些蛋白的活化能够引起细胞焦亡;而后科学家利用全基因组CRISPR文库筛选,发现了细胞焦亡信号通路的关键分子gasdermin D (GSDMD)。并阐明了GSDMD作为caspase底物蛋白,在被切割后能够引发细胞焦亡的分子机制。
Interdomain cleavage of GSDMD is sufficient to trigger pyroptosis4 CRISPR-Cas9技术作为近年来热门的基因编辑技术,凭借其精准、简便、高效的特点受到众多研究者的关注,短短几年间已成为基因编辑领域中最热门的技术,被广泛应用于生物、医学等领域。基于CRISPR文库筛选的这种高通量功能性筛选技术也逐渐取代了RNAi和cDNA文库,为功能基因的研究提供了高通量高效率的筛选工具。CRISPR文库筛选已经在药物或毒素抗性基因筛选、潜在治疗靶标筛选、肿瘤转移等相关基因筛选方面取得了重要进展,未来CRISPR文库筛选也必然在整个生命科学领域中得到更广泛的应用。
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参考文献 1. An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance. Bester AC, et al. Cell. 2018. PMID: 296775112. CRISPR/Cas9 Screens Reveal Epstein-Barr Virus-Transformed B Cell Host Dependency Factors. Ma Y, et al. Cell Host Microbe. 2017. PMID: 284942393. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Steinhart Z, et al. Nat Med. 2017. PMID: 27869803 4. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Shi J, et al. Nature. 2015. PMID: 26375003 |