在进行qPCR实验之前,我们需要先制备cDNA,而cDNA样本质量的好坏会直接影响后续qPCR的实验结果,所以如何获取高质量的cDNA样本就是qPCR实验的首要难题。
RNA样本的质控 RNA的二级结构 RNA由于自身序列折叠,具有不同复杂的二级结构:配对的双链RNA呈螺旋,发卡环,突环,内环,多分支环等结构。由于配对碱基不同,其配对的稳性也不同,如G与C之间的配对,三对氢键,最为稳定。A与U为两对氢键相互作用;G与U为一对氢键相互作用,最不稳定。故对于RNA模板来讲,GC含量越高,二级结构越为复杂(图a)。 在进行反转录的过程中,当引物延伸到有二级结构的地方,反应就会被迫终止,影响cDNA的合成长度。此时可建议先将模板进行65℃孵育5 min然后迅速冰上冷却使二级结构变性;同时可通过在较高的温度下(如55℃)反应以降低RNA二级结构的形成。 图a:RNA的二级结构 (图源:Turner, D. H. , & Mathews, D. H. . (2009). Nndb: the nearest neighbor parameter database for predicting stability of nucleic acid secondary structure. Nucleic Acids Research, 38(Database issue), D280-2.)
RNA纯度和浓度的测定 RNA纯度会很大程度地影响反转录实验,如RNA纯化过程中混入的盐、金属离子、乙醇等均是常见的逆转录酶抑制剂。对于RNA纯度的测定,通常会选用Nano drop进行测定。纯度完好的RNA:1.8<OD260/OD280<2.0(<1.8时表明有蛋白质或酚污染,可增加酚抽提;>2.0时表明可能有异硫氰酸残存);OD260/OD230应大于2。(<2表明有异硫氰酸胍,β-巯基乙醇或乙醇的残留;可进行再次沉淀,重复乙醇洗涤)。
避免RNA酶污染 RNA的完整度在很大程度上影响着cDNA合成的长度与质量。在进行RNA提取处理储存和实验过程中需要采取特殊的保护措施,如操作者佩戴手套和口罩,全程使用无RNA酶污染的实验耗材等。对于下游的克隆实验,RNA完整度将会影响cDNA的合成长度,从而影响目的基因的合成。对于下游的目的基因定量实验,将会严重影响其CT值,从而影响定量结果精准度。
gDNA清除 在进行下游qPCR实验过程中总RNA中混入的gDNA可直接作为PCR反应的模板进行扩增,造成实验结果的假阳性。因此在反转录之前必须要对RNA模板进行去gDNA处理,保证模板中仅有cDNA。可通过加入DNaseⅠ去除gDNA。但是在反转录实验前需将DNaseⅠ灭活(通过高温加热或加入EDTA),否则该酶会将cDNA降解,但是高温灭活DNaseⅠ会造成RNA的降解和损失,加入EDTA灭活又会引入新的RNA酶抑制剂。近岸蛋白的反转录试剂盒内含基因组DNA消化酶,可以通过一步法去除gDNA,RNA反转录和gDNA消解在同一反应中完成,在保证实验结果的前提下为您节省了宝贵的实验时间,同时gDNA的去除效果相较同类产品更加优秀。
反转录引物分类 Oligo(dT) Oligo(dT)引物是约12-18个多聚胸腺嘧啶T组成的重复寡核苷酸序列,能够特异性地与真核生物mRNA的ploy(A)尾退火,故不适合缺少ploy(A)尾结构的RNA,如原核生物RNA或miRNA,也不适用于已降解的RNA,如FFPE样品中RNA。 真核生物中mRNA仅占总RNA的1%-5%左右,通常在进行从真核生物中构建cDNA文库,或者克隆全长cDNA以及3’RACE等研究时会优先选择 Oligo(dT)引物。 对于复杂模板RNA,如含较多二级结构,在进行cDNA的合成延伸过程中,当延伸到二级结构处时,可能会造成延伸终止,若选择Oligo(dT)可能会造成mRNA 5’端信息的丢失。
Random N6-N9 随机引物是由随机碱基组成的寡核苷酸,通常由6个核苷酸组成,称为随机6聚体。该种引物不具备特异性,rRNA, tRNA,非编码RNA,小RNA,降解RNA,复杂二级结构的RNA等都可以作为其模板。该类引物可提高cDNA的产量和浓度,但是会使合成的cDNA长度变短。
基因特异性引物 基因特异性引物能够与模板特异性互补,产生目标性很强的cDNA,对于后续的PCR扩增更特异,适用于已知目的序列。通常应用于一步法qPCR反应。当使用基因特异性引物(GSP)无法有效合成第一链cDNA时,可选用Oligo(dT)或随机引物,尤其是针对miRNA这种小片段RNA,使用常规引物进行反转录较为困难,因此需要设计特殊的引物将cDNA长度从原始的20nt增加到60nt以上。具体办法有两种:茎环法逆转录和末端加A法逆转录。其中茎环法特异性更高,常用的mRNA逆转录及qPCR试剂盒就可以做。加A尾法需要单独购买逆转录及qPCR试剂盒,且逆转录引物与qPCR下游引物序列保密,无法得知,因此成本相对高一些。
茎环法逆转录原理 图 茎环法逆转录原理 (图源:Varkonyi-Gasic, E. , Wu, R. , Wood, M. , Walton, E. F. , & Hellens, R. P. . (2007). Protocol: a highly sensitive rt-pcr method for detection and quantification of micrornas. Plant Methods, 3(1), 12-12.)
由于miRNA在20bp左右,无法根据其设计引物进行检测,可以先将其延长,也就是先加一个环状片段,这样就使得原来20bp左右的延伸为80bp左右了,然后就可以根据这个80bp片段设计引物。茎环法逆转录需要三种引物:逆转录引物(RT-primer,用于延长miRNA)+qPCR上游引物、qPCR通用下游引物。 逆转录引物序列由5’端茎环结构引物和3’端miRNA特异性序列组成,5’端茎环结构通常固定,其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。3’端特异性序列由与成熟的miRNA 3’端若干寡核苷酸反向互补配对所得。
RNA逆转录酶 不同的逆转录酶具有不同的功能活性,表现出不同的逆转录效率,如合成cDNA的长度,产量,对复杂模板的适应程度等。 1. 热稳定性:此性能是影响cDNA合成的重要因素。升高反转录过程中的温度,有助于高GC或复杂二级结构RNA模板的变性,实现全长cDNA的合成。 2. 保真性:RNA反转录为cDNA过程中的序列精确度。由于逆转录酶不具备3’-5’外切酶活性,因此没有校正功能,所以合成的cDNA出错率较高。通常,除测序对精准度要求较高外,其他情况下,反转录中引入的错误数量可忽略不计,因为cDNA中的错误不会被放大。 3. 抗抑制能力:当模板纯度较低、抑制物较多时,抗抑制能力强的逆转录酶才能正常进行cDNA的合成。
针对不同的实验要求,需要选择最合适的逆转录酶,近岸蛋白的NovoScript II Reverse Transcriptase耐高温逆转录酶,可以大幅提高热稳定性和cDNA合成效率;并且该产品无RNase H活性,可避免第一链cDNA合成过程中,RNA/DNA杂交模板链中RNA降解,保证cDNA合成的质量。该酶可以在高温条件下(50~60℃)进行cDNA第一链的合成,高温条件下有利于打开复杂RNA模板链。该酶最佳反应温度为50℃,具有热稳定相强,灵敏度高,特异性高,聚合能力强等优点。
RNA反转录及cDNA质检 对于反转录酶活性来说,二价阳离子是必需的。对于大多数反转录反应,建议加入氯化镁至镁离子终浓度为2.5 mM 以得到最佳结果,可在1.5到5mM范围内调整优化。对于长片段RNA的反转录,可以降低镁离子浓度以提高延伸的完整性;短片段RNA的反转录,可以提高镁离子浓度以提高反转录的效率。反转录温度通常推荐使用42℃,对于高GC含量模板或者复杂模板,可将反转录温度提高到50℃。反转录产物可立即用于qPCR反应,也可-20℃短期保存;若需长期保存,建议分装后,于-80℃保存,避免反复冻融。 RNA反转录完成后,通常需要对反应生成的cDNA产物进行质检,质量检测手段一般有以下几种: cDNA 电泳检测 取约 5 μl 反应产物,在 1% 琼脂糖凝胶上电泳,EB 染色,紫外成像检测,呈现出大小在 200~10Kb 的条带,其中重心区域在 1~4Kb 之间,这说明反转录完全,得到了高质量的 cDNA(如果 RNA 丰度低,电泳也可能是无产物,但是这种情况不代表 PCR 会无结果)。
cDNA 测序(受限较多,但结果精准) 全长双链 cDNA 做分子克隆实验,然后通过测序结果精确判断。 1)Oligo(dT)18和 Random Primers 按比例使用可解决 poly(A) mRNA 模板限制和长度限制的问题 2)序列特异性引物可获得目的序列
探针检测(相对较麻烦,但结果较精准) 采用探针法qPCR对cDNA产物进行检测,然后通过qPCR结果精确判断。
近岸蛋白的NovoScript®Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)(目录号:E047)作为广受好评的科研主打产品有如下几个优点: 高温反转录:反应温度为50℃,RNA二级结构更容易被打开,从而使更多的RNA被反转录,进而实现长片段cDNA的合成; 操作简单:Mix形式,只需加入RNA模板和水,避免污染; 去基因组:反转录时同步去除基因组DNA 污染,提高定量; 准确性强:对M-MuLV(RNase H-)进行基因工程改造,具有灵敏度高,特异性高,聚合能力强等优点; 强稳定性:37℃放置7天性能稳定。
NovoScript®Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge) 实验数据
对于需要对miRNA进行反转录的同学,近岸蛋白也提供了NovoScript® miRNA First-Strand cDNA Synthesis and SYBR qPCR Kit(目录号:E172-YH01),同近岸蛋白也提供了NovoScript® One-Step RT-PCR Kit(目录号:E045)通过一步法将cDNA合成和PCR反应合并到一个管中进行,反转录结束后可直接进行PCR循环而不用增加额外的步骤;同时可对低至0.1ng的总RNA进行扩增,有助于大量样品的处理并减少污染机会。
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