Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。小博今天给大家介绍一下Western Blot的关键原理,以及一些典型Western Blot问题的解决方案,希望对大家有所帮助。 定义介绍 Western Blot,即蛋白质印迹法(免疫印迹试验),是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体进行检测。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
原理介绍
Western Blot原理与Northern Blot、Southern blot类似。三种方法都采用电泳来分离样品,然后将样品转移到稳定的膜上并随后进行探测。Western Blot法采用的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(也称为SDS-PAGE),被检测物是蛋白质,"探针"是抗体,"显色"用标记的二抗。 具体而言,Western Blot使用SDS-PAGE按蛋白大小分离蛋白质样品,将其转移到硝酸纤维素薄膜上,分别用一抗、二抗来孵育硝酸纤维素膜,形成蛋白质—第一抗体—第二抗体—酶复合物。然后用信号分子(显色,化学发光或荧光)直接检测抗体,或用标记的二抗间接检测抗体。
疑难杂症 1、低/不可检测信号
2、高背景
3、多个正频带
4、其他
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