世界上绝大多数组织样本是使用福尔马林固定石蜡包埋的方法(formalin-fixed, paraffin-embedded,FFPE)处理。想要提取出其中的核酸,是很有难度的。 FFPE样本纯化难点
福尔马林造成生物分子交联 核酸对甲醛反应可分为两个阶段:①早期出现碱基快速可逆转羟甲基化;②数天后使核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。所以,甲醛固定时间不宜过长也不宜过短。
核酸严重片段化
从常规组织处理的蜡块中提取的DNA,其大部分分子量在100 bp-10 000 bp之间,主要分布于100-1 500 bp,仅约 1/3 的组织所提取 DNA>20 kb。这除与固定剂、固定时间等因素有关以外,可能的原因还有:
1. 组织从外科切除到固定之间的时间长短不一,当组织未固定或固定不充分时,核酸酶会发挥作用降解核酸。 2. 不同肿瘤中的核酸酶水平不一,其在固定过程中会发挥不同作用。 3. 石蜡块储存时间长短不同。
注意:DNA 和蛋白的交联必须去除才能使DNA有效释放出来,并进行纯化,由交联引起的化学修饰也应该逆转。修饰的 DNA 不仅不利于纯化回收,在后续的酶反应过程中也是一个低质量的底物。但是在去除交联和逆转化学修饰的过程中必须很小心,任何剧烈的反应都会造成核酸的进一步片段化。 核酸纯化要点 蜡块的选择 从福尔马林固定的组织标本中未能提出完整的高分子量 DNA 的重要原因之一,是应用了固定不充分的组织。因此,在 DNA 提取前应检查组织切片。如果有自溶、退变或组织结构不清,大片出血等改变的蜡块不能用;若有明显坏死存在的蜡块,最好不用或将坏死部分切去后再用,尽可能地选用新近标本。 酶浓度 适当地增加蛋白酶 K 浓度和延长消化时间将有利于组织消化和 DNA 的释放。通过比较不同浓度蛋白酶 K 对 FFPE 的消化效果后发现, 消化液中蛋白酶K 浓度越高, 消化时间越长则获取的 DNA 量越多。然而, 随着蛋白酶 K 浓度的升高, 提取的 DNA 数量虽然增多, 但质量反而有所下降, 对较大 DNA 片段( 大于200 bp) 进行 PCR 扩增的成功率也下降。 脱蜡方法 因为石蜡的存在是一大障碍,若不能从反应液中彻底清除,将形成 DNA-石蜡混合物,不利于 PCR 扩增。因此组织切片脱蜡必须彻底。脱蜡方法中主要有有机试剂脱蜡和加热脱蜡,有机试剂脱蜡通常采用二甲苯。用二甲苯脱蜡比较彻底,利于组织消化,但是过多的操作步骤增加了 DNA 受污染的可能, 亦容易人为地造成 DNA 机械性损伤, 并且需要接触有毒物质二甲苯。
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