Cell Host：吕惠彬等探究 H3N2 抗体进化获得 H5N1 交叉保护机制

甲型流感病毒（Influenza virus）仍然给全球公共卫生和社会经济带来巨大威胁。每年，流感流行导致约  300 万至  500 万例重症病例，以及  29 万至  65 万例死亡。在病毒大流行年份，甲型流感病毒甚至可能在全球范围内造成数百万人的死亡。甲型流感病毒具有两种主要的表面抗原：血凝素（hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶（neuraminidase, NA）。HA 通过与含唾液酸受体结合并介导病毒与宿主膜的融合来介导病毒进入宿主细胞，而  NA 通过切割唾液酸促进病毒的释放。HA 和  NA 分别被分为  19（H1–H19）和  11（N1–N11）个亚型。

其中，H17–H18 和  N10–N11 仅在蝙蝠中发现，其余亚型均存在于水禽中。众所周知，水禽是甲型流感病毒的天然宿主。目前在人群中流行的主要亚型是  H1N1 和  H3N2。然而，其他禽源流感亚型偶尔也会传播及感染人类。从 2024 年起，在美国奶牛中广泛检测到高致病性禽流感（HPAI）H5N1 2.3.4.4b 分支病毒，引发了潜在  H5N1 大流行的担忧。随后，美国报告了多起  HPAI H5N1 人感染病例，其中包括一例死亡病例，进一步加剧了这一威胁。

Credit to https://www.nature.com/articles/s41586-024-08054-z

目前季节性流感疫苗是预防流感病毒感染的最有效措施，但它们无法对人畜共患的流感亚型提供保护。因此，能够对多种人源和人畜共患亚型提供广泛保护的流感疫苗对大流行防控至关重要。自近二十年前发现针对  HA 的广谱中和抗体以来，广谱流感疫苗的研发主要集中在  HA 上。然而，近年来也发现了多种针对  NA 的广谱人源抗体，其中一些能同时识别 NA 组 1（N1、N4、N5、N8）和 NA 组 2（N2、N3、N6、N7、N9）NA，代表性抗体包括  FNI9, 4N2C402, 1 G01, Z2B3, DA03E17, NCS1.2,  以及  mAb-297。这些广谱  NA 抗体的发现突显了  NA 作为广谱流感疫苗靶点的重要性。

Credit to https://www.intechopen.com/chapters/81675

多项研究表明，尽管季节性流感疫苗诱导的  NA 抗体反应较弱，但  NA 抗体对防御人畜共患亚型具有关键作用。例如，1968 年  H3N2 大流行期间，已有研究显示人群中预存的  H2N2 NA 抗体能提供一定保护。最近的血清学研究进一步表明，尽管人类对  H5N1 2.3.4.4b 分支病毒几乎没有预存的  HA 中和抗体，但广泛存在能够抑制该病毒  NA 活性的抗体。这些发现提示，预存的  NA 抗体可能在未来  H5N1 大流行中对降低发病率和死亡率发挥关键作用。然而，针对  H5N1 2.3.4.4b 分支病毒的预存  NA 抗体产生的分子机制目前仍不清楚。

近日，来自伊利诺伊大学香槟分校的 Nicholas Wu 和吕惠彬团队与香港中文大学 Chris Mok 团队合作在 Cell Host & Microbe 杂志发表了文章 Evolution of antibody cross-reactivity to influenza H5N1 neuraminidase from an N2-specific germline，他们通过噬菌体展示技术，以  H5N1 神经氨酸酶（NA）作为筛选靶标，鉴定出一株可交叉结合不同 NA 的抗体  HB420。通过体外和体内活性实验验证其抗体保护作用，并应用冷冻电镜（cryo-EM）结构分析进一步揭示，HB420 通过模拟受体的方式靶向  NA 保守活性位点，该作用由互补决定区（CDR）H3 中的一个天冬氨酸（Asp）残基介导。另外，尽管 HB420 种系（germline）抗体无法结合  H5N1 NA，但  HB420 可以通过重链的体细胞高频突变（SHMs）获得了对  H5N1 NA 的交叉反应性。

首先，作者在 2020 年（牛 H5N1 病毒流行之前）在香港红十字会收集的 245 个血浆样本，在血清学上评估了预存免疫抗体针对不同流感病毒 NA 蛋白（H1N1，H3N2，H5N1，H10N3，H7N4，H3N8）的结合抗体水平（图 1），结果显示，不同年纪的人群虽然未接触 H5N1 病毒，但是与季节性流感 H1N1 和 H3N2 一样，体内已具有不同程度结合 H5N1 NA 的结合抗体。这些预存抗体可能是来源于 H1N1 A/California/04/2009 NA 的印记反应。在这个血清学（多克隆抗体）的基础上，作者紧接着探究在分子水平上（单克隆抗体）这种交叉反应是如何发生的。

图 1：血清学水平分析预存抗体水平

作者应用噬菌体展示技术，构建了包含 245 人的抗体展示库，并以  H5N1 神经氨酸酶（NA）作为筛选靶标（图 2）。通过筛选，我们鉴定出一株可交叉不同 NA 的抗体  HB420。该抗体不仅能够结合  H5N1 NA，还能结合  H3N2 NA。体外实验显示，HB420 对  H3N2 NA 的抑制活性明显强于对  H5N1 NA 的抑制，但是在体外能够抑制  H3N2 病毒的生长而不能抑制  H5N1 病毒。

图 2：HB420 抗体的发现

紧接着，在抗体体外活性的基础上，作者探究了其在老鼠体内的保护活性（图 3-4）。结果有趣的显示，虽然体外实验中 HB420 不能够抑制 H5N1 病毒，但在体内实验中，它对  H3N2 和  H5N1 病毒均表现出保护作用。

图 3: H3N2 病毒保护实验

图 4: H5N1 病毒保护实验

在体内体外实验的基础上，作者继续探究在分子水平上，HB420 是如何产生 H3N2 NA 和 H5N1 NA 交叉活性的。作者应用冷冻电镜（cryo-EM）结构分析进一步揭示，HB420 通过模拟受体的方式靶向  NA 保守活性位点，该作用由互补决定区（CDR）H3 中的一个天冬氨酸（Asp）残基介导（图 5）。

图 5: 冷冻电镜 HB420 抗体结构解析

同时，作者也通过比较了其他的 NA 交叉活性抗体发现，大部分 NA 交叉活性抗体具有一个通用的 DR/RD 序列基序，但是在 HB420 上只有单一的 D 氨基酸介导了类似于唾液酸结合受体的反应（图 6）。

图 6: 不同 NA 交叉活性抗体比较

最后，作者继续探究 HB420 抗体的发育路径（图 7），尽管 HB420 种系抗体（不携带体细胞突变）无法结合  H5N1 NA，但其与  H3N2 NA 的结合能力仍然很强。抗体突变实验近一步分析结果表明，HB420 是通过重链的体细胞高频突变（SHMs）获得了对  H5N1 NA 的交叉反应性。

图 7: 抗体发育路径

通过这个研究，作者在分子水平上解析了一个 H3N2 NA 抗体如何发育到 H5N1 NA 交叉抗体的进化路径，一方面为血清学水平发现提供依据，另一方面为流感通用疫苗设计提供思路。

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