实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问做 WB，一抗和 marker 怎样选取？

xzmcjxj

个人觉得一抗的话是abcam，cell signaling technology,santa cruz,bioworld这几家公司的不错，也比较常用，购买一抗的时候要注意它的试用范围，比如说使用的物种，主要就是H\M\R，指的是人、小鼠和大鼠，还有就是它适合做哪些实验，最常规的就是WB\IF\IMH等。而marker的话就是要根据自己的目的蛋白的大小来决定了，一般选接近的，如果分子量比较小的话就

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问组织切片做免疫荧光，背景色太重怎么办？

shy890726

背景色成因分两方面一、组织切片因染色过程或组织非特异荧光而出现的背景色二、拍照时因硬件设施或取景器设置而出现的背景色。针对第一种问题有以下几点建议：1. 采用高品质的多聚甲醛固定减少普通甲醛的自发萤光 2. 切片厚度减薄 3. 切片贴片后流水冲洗干净减少杂质荧光 4. 一抗以及二抗漂洗干净！（非常重要） 5. 选用高品质封片介质。针对第二种问题有以下几点建议：1. 曝光时间的控制 2. 暗室操

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问ECL 试剂盒荧光特别弱怎么办？

hbzwwxclxq

一般ECL发光液我们实验室是在用之前从4度取出配好需要的量，然后马上放回4度冰箱，很多人是拿出来一直常温下放着等曝完光再放回冰箱，这样可能就会影响到效果哦，还有就是注意有效期吧。。。。

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问细胞未出凋亡，可能的原因是什么？

alaling

如果你确定这个药物对正常人的窗口上限是200微摩尔，那么这个细胞系很可能就是对你的药物是耐药的。究其原因有两个，一个是其天生耐药，另外一个，也是最大的可能就是这个细胞株是经过低浓度药物培养起来的耐药株。所以传代越多不太会产生耐药性，但如果你这本身是低浓度药物培养起来的耐药株，就会出现耐药的情况。由于很多细胞系经过无数传代，其中又经过无数处理，记录不清的情况非常常见，所以细胞很容易出现类似的耐药

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问为什么 DAB 显色实验的条带弄干后总是白色？

200210lee

浓度过高，过曝了。建议降低样品，一抗，二抗浓度。

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问实验设计中的问题：提取膜蛋白（受体蛋白）后做western好出结果么？

尼克酰胺腺嘌呤二

无论是提取过程还是WB过程都需要做仔细一些，可以用一些好的产品。

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问如何让分离胶面平整？

名闻天下

可能你的胶槽不平，第二你的压胶的液体太少，至少1ml，第三，你必须要等胶干了才能晃动胶槽，夏天至少30min，冬天更久50min，我一般加的纯水好像没什么事。。

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问求助啊 Promega 的 Psi-check 2 vector 的测序引物是什么呀

iternol

psiCHECK-F GCAACTACAACGCCTACCTTCGG psiCHECK-R CGAAAAGGTCACACTCTGGGGCG你再网上找到质粒序列后就可以找到引物的位置了

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问western blot 实验中组织提取蛋白最小量是多少？

勇者无疆2011

这个要看你的目的蛋白在你的这个标本--肺动脉里面表达的量的多少了，如果太少了，那估计是不行哦，但表达丰度较高，那肯定可以了。

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问野生型能不能像转基因小鼠一样繁育？

changyueli

1.野生型的国内购买就可以了；2.野生型的当然能像转基因小鼠一样繁育，而且最好是保持相同的饲养条件。

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问在 NCBI 查询到人类的 CD209 有好多条 mRNA 该如何选取？

dengchch

有好多条mRNA是因为这个基因有不止一个转录本，一般情况下是选择最长的转录本进行克隆，当然如果别人有报道说不同的转录本有不同的功能的话最好还是都克隆并研究一下。基因的编码区和启动子序列在NCBI网站上都能查到，你搜索时用gene这个选项卡，然后搜你的基因，在结果中选人的该基因，然后分别去找相关信息。其中编码区就是CDS。设计引物时，如果你要克隆基因，那肯定引物要在CDS区两端，因为你要扩的是完整的

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问电泳，有时抛出两条条带，有时是一条条带，两条条带分子量相差不大，可能是什么原因造成的？

hl16010921

1.电泳的原因，相差不大的蛋白有时没有分开。染色，脱色未到最佳等。就是两条带没分开，或丢失一条。2.样品原因。部分降解，修饰（磷酸化，乙酰化等），相近蛋白的干扰。3.样品原因的话，某一样品结果是不可逆的，一条带变两条，而后该样品一直是两条带。电泳的问题是随机的，忽而一条，忽而两条。4.电泳，问题可能大。稳定电泳条件，特别是防止局部过热。

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问求无进展生存率（DFP）的计算方法？

elite_xy

简单说，就是一个病例从你给他治疗开始算，如果你每2个月做一次随访的话，如果第6个月病例的病情有所发展，那么他的PFS就是4个月。当然有些病人的病例不会有发展，统计一下无发展的人数，除以病例数就可以了

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问在 DNA 的退火过程中，不小心把温度搞到 45℃（要求55℃）了，怎么办？

elite_xy

毫无影响，希望你不是说退火温度设定到了45℃

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问能够染大鼠MCAO的脑切片么？能够观察的细胞是哪类的？

200210lee

有多糖的细胞或组织

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问从大鼠股骨中用液氮研磨后提取蛋白也是跟常规的组织提取蛋白用的试剂一样吗？

南瓜先生86

如果是提取核蛋白还需要加提取核蛋白的裂解液

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问鼻咽癌 CNE2 细胞培养过程中形态为啥会变（梭型变成多边形）？

dengchch

其实CNE2也不是完全是梭形吧。有的是梭形，有的多边形，尤其是像CNE2这种细胞。我们研究部有挑过CNE2细胞的单克隆，发现一些克隆是主要呈梭形，一些则呈现多边形或不规则形状，梭形的细胞一般恶性较强。所以CNE2可以认为是一个混杂了多种类型细胞的细胞系，这其实也符合癌症细胞异质性的理论。我觉得只要细胞状态正常，性状与之前基本一致，确定没有其它细胞污染，就可以用来做实验。

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问细胞划痕试验的第 3 步是否要去除培养基？

yiyao111

划痕前是不倒培养基的，划痕后再倒掉培养基加PBS清洗后加吴学谦培养基；细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。因此是整个培养皿都加培养基的，观察部位是划痕而已

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问PCR 结果出现弥散现象的原因？

ziye_1988

有很多原因啊，比如说模板加的太多了，建议体系参考酶的说明书，具体原因和解决办法参照分子克隆上册PCR那一张（好像是第八章）~

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问见不到荧光是为什么？

zhangwan8686

主要问题是抗体浓度和一抗二抗结合不够，尝试提高二抗浓度，延长二抗反应时间，另外，一抗可以做梯度实验，找寻一抗二抗最佳比例

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