小鼠胚胎干细胞培养时，最容易出现哪些意外情况，如何避免？

在培养细胞的时候最容易出现环境污染、细胞死亡、增长停止等情况；

避免方法：严格的规范操作

一、在培养细胞的时候出现环境污染、细胞死亡、增长停止等情况；

二、自己准备的MEF细胞培养出的胚胎干细胞并不是很好尤其是在hES时长势很不好但是却找不到其中的原因。

需要注意如下问题：

1.细胞培养时要规范标准。

(1)严格控制无菌操作。

(2)培养环境需要每日观察。

(3)细胞培养基及相关试剂的选择。培养时会用到培养基、血清、试剂等物品但是选择的产品应该是出自正规厂家的优质产品，劣质的产品往往技术不过关其中包含很多有害物质因此不建议不够。

2.细胞扩增时间过长导致细胞老化、生长缓慢。通常MEF细胞培养到3-4代后，增长速度就会明显变慢，因此我们建议培养一段时间后应该用丝裂霉素进行处理、技术并冻存，在需要细胞时复苏后即可使用。

3.hES对培养层细胞的要求。

(1)品系要求不同。现在我们所用的细胞大多数是来自WiCell 的H1、H9等这些都适合CF-1小鼠的饲养层细胞。但是国内常用的今昔小鼠如果作为hES饲养层来说并不适合。

(2)hES饲养层的小鼠细胞应该采取不大于12.5天的小鼠胚胎。

(3)不能够无限扩增通常第二代就应该用丝裂霉素处理。

(4)在铺饲养层之间必须用基质胶来处理下培养板或培养皿。