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        DNA和RNA核酸稳定性问题

        相关实验:菌种保藏实验

        user-title

        Lee_xsht

        单链DNA和RNA在什么溶液中稳定?制作标准曲线做qPCR,分别用什么溶液稀释?稀释有什么注意事项?

        wx-share
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        3 个回答

        user-title

        迟C迟

        有帮助

        qPCR实验中的DNA模板直接用ddH2O稀释就好了,不要用TE buffer,里面有盐离子,会影响PCR效率。

        user-title

        天一湖医者

        有帮助

        对于标准曲线,尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段,即曲线几乎成直线的范围内。最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度,这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。

        注意事项:

        1、连接反应的温度:DNA连接酶的zui适反应温度为37℃,但在此温度下, 粘性末端的氢键结合很不稳定,折衷方法是12℃过个夜。
        2、DNA的平未端和粘性末端:由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端,因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。粘性末端效率高,因而在底物浓度,酶浓度选择上是有差异的。
        3、 碱性磷酸酶处理质粒载体:为了提高连接效率,一般采取提高DNA的浓度,增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题, 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理,除去其5’末端的磷酸基,防止环化, 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。
        4、连接反应的检测:连接反应成功与否,zui后的检测要通过下一步实验,转化宿主菌, 阳性克隆的筛选来确定。
        5、如果要检验连接酶和连接酶的缓冲液是否有效,可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功,则说明有效。

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        DNA在TE buffer中比较稳定,RNA在无RNA酶的depc水中稳定。制作标准曲线做qPCR,可以用超纯水直接稀释就好,但是梯度稀释

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