MHC四聚体怎么做啊？检测抗原特异性T 细胞增殖

制备MHC（主要组织相容性复合物）四聚体用于检测抗原特异性的丁细胞增殖是一个复杂的实验过程。以下是一般的步骤概述：

1. 克隆T细胞：从免疫动物或人体中获得特定的T细胞克隆，这些细胞在识别和结合特定抗原时会发生增殖。

2. 提取MHC分子：从目标组织或细胞中提取目标MHC分子，通常是MHC I或MHC II分子。

3. 生物素化：将目标MHC分子与生物素标记的分子（例如生物素化的二抗）进行反应，以引入生物素标记。

4. 四聚体形成：将生物素化的MHC分子与荧光标记的四聚体结合配体（例如荧光素化的琼脂糖），形成MHC四聚体。

5. 细胞染色：将目标T细胞与MHC四聚体进行孵育，使四聚体与特定的T细胞受体结合。

6. 流式细胞术分析：通过流式细胞仪对T细胞进行分析，以确定是否发生了四聚体与T细胞受体的结合，进而确定抗原特异性的丁细胞增殖。

一、MHC四聚体染色基本操作流程

（一）所需主要试剂和设备

（1）欲检测的细胞或全血；

（2）荧光染料标记Anti-CD8抗体或其它抗体；

（3）离心机、流式细胞分选仪等。

（二）基本操作流程

细胞准备

1）外周血单核细胞、脾细胞、淋巴细胞、常规细胞系细胞等，以2-5×107/ml的密度重悬于FACS Buffer（PBS+ 2%小牛血清+0.1%叠氮钠；建议使用时新鲜配制），制备成细胞悬浮液。

2）取25ul细胞悬浮液滴加入微孔培养板或FACS试管。

Staining Cocktail制备

3）制备2X Staining Cocktail：FACS Buffer+ MHC四聚体（建议稀释比例为1:50～1:100）+ Anti-CD8/FITC抗体或其他用作内参的抗体（请参考其说明书进行稀释）。

染色孵育

4）取25ul 2X Staining Cocktail，滴加入步骤2中的微孔培养板或FACS试管，与细胞悬浮液混匀。（注意：使用移液器轻柔上下吹打混匀，尽可能避免产生气泡。）

5）在冰上或其他已通过实验优化确认的最佳温度条件下，避光孵育60 分钟。

洗涤

6）加入150ul FACS Buffer至微孔培养板每孔或2-3ml FACS Buffer至FACS试管，轻柔混匀，避免形成气泡，1200 rpm离心5 min，小心除去上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。（注意：对于具有传染性或危害性的样本，可考虑使用吸引器，轻柔吸掉上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。）

7）重复步骤6，再洗涤2次。

细胞固定&流式分析

8）将细胞重悬于200ul固定液（PBS+1%多聚甲醛（PFA））中，使用流式细胞仪进行样本分析。

MHC-肽四聚体技术，其具体原理是借助生物素-链霉亲和素系统，将 MHC-肽复合物四聚化，可与细胞表面的多个 TCR 结合，从而大大提高了MHC-肽复合物与TCR 的亲和力和稳定性。

MHC四聚体染色基本操作流程

（一）所需主要试剂和设备

（1）欲检测的细胞或全血；

（2）荧光染料标记Anti-CD8抗体或其它抗体；

（3）离心机、流式细胞分选仪等。

（二）基本操作流程

细胞准备

1）外周血单核细胞、脾细胞、淋巴细胞、常规细胞系细胞等，以2-5×107/ml的密度重悬于FACS Buffer（PBS+ 2%小牛血清+0.1%叠氮钠；建议使用时新鲜配制），制备成细胞悬浮液。

2）取25ul细胞悬浮液滴加入微孔培养板或FACS试管。

Staining Cocktail制备

3）制备2X Staining Cocktail：FACS Buffer+ MHC四聚体（建议稀释比例为1:50～1:100）+ Anti-CD8/FITC抗体或其他用作内参的抗体（请参考其说明书进行稀释）。

染色孵育

4）取25ul 2X Staining Cocktail，滴加入步骤2中的微孔培养板或FACS试管，与细胞悬浮液混匀。（注意：使用移液器轻柔上下吹打混匀，尽可能避免产生气泡。）

5）在冰上或其他已通过实验优化确认的最佳温度条件下，避光孵育60 分钟。

洗涤

6）加入150ul FACS Buffer至微孔培养板每孔或2-3ml FACS Buffer至FACS试管，轻柔混匀，避免形成气泡，1200 rpm离心5 min，小心除去上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。（注意：对于具有传染性或危害性的样本，可考虑使用吸引器，轻柔吸掉上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。）

7）重复步骤6，再洗涤2次。

细胞固定&流式分析

8）将细胞重悬于200ul固定液（PBS+1%多聚甲醛（PFA））中，使用流式细胞仪进行样本分析。