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        有做THP-1巨噬细胞M2极化成功的吗?

        相关实验:人单核/ 巨噬细胞的表型检测

        user-title

        越努力越心酸

        本人按文献上的方案用IL-4、IL-10刺激THP-1巨噬细胞M2极化,流式检测CD163无表达,有没有大神做成功的呀,求一个protocol

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        3 个回答

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        建议添加pma,可以提高极化成功率

        user-title

        huarenqiang5

        有帮助

        可以按以下步骤进行:

        1、THP-1-M0 巨噬细胞分化 将THP-1 细胞按1×106~2×106个/mL 密度接种于完全培养基中,置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养,每2~3 d 换液。分别用50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L PMA 刺激THP-1 细胞48 h,诱导转化为M0型巨噬细胞,每组设置3个复孔,倒置相差显微镜下观察THP-1细胞形态,筛选PMA的最佳刺激浓度。

        2、细胞因子诱导THP-1-M0 向M1 型和M2 型极化 PMA刺激后,用RPMI-1640完全培养基培养细胞24 h,加入10 pg/mL LPS 和20 ng/mL IFN-γ 处理72 h,使M0 向类M1 型细胞方向极化,得到THP-1-M1;加 入20 ng/mL IL-4 和20 ng/mL IL-13处理THP-1-M0 使其向类M2 型方向极化,得到THP-1-M2。

        3、取对数生长期的细胞以适当密度接种于T25 细胞培养瓶中,待细胞完全贴壁后,换新鲜的完全培养基继续培养48 h,细胞汇合度达到80%时收集培养上清液,用0.22 μm 孔径的细胞滤器过滤细胞碎片,4 ℃、3 000 r/min 离心5 min,取上清。按1∶1 体积比加入新鲜完全培养基,分别配置5-8F 和HONE1 细胞的条件培养基,加入THP-1 源M0 细胞中,处理48 h,以不作处理的M0 细胞作为阴性对照组,实验组为5-8F-M0及HONE1-M0。用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测多个标记物表达,分析THP-1来源的巨噬细胞极化方向。

        4、流式细胞术检测巨噬细胞CD14、CD68、CD86、CD163、CD206表达 胞外流式抗体的检测:PBS冲洗,消化细胞,25 ℃、1 000 r/min 离心5 min,弃上清,用细胞染色缓冲液重悬细胞,制成终浓度为1×106~10×106个/mL 的细胞悬液,加入抗体,室温避光孵育30 min,染色缓冲液洗涤、重悬细胞,过滤后上机检测。

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        THP-1是一种人类单核细胞系,可以通过化学诱导方式使其分化成巨噬细胞。M2极化是一种特定类型的巨噬细胞激活状态,可以通过添加特定的生长因子和细胞因子来实现。以下是一个可能适用于您的实验的M2极化方案:

        THP-1细胞培养和分化:

        将THP-1细胞在完整的RPMI 1640培养基中培养至细胞密度为2x10^5/ml。

        将12-Phorbol-13-myristate acetate(PMA)加入到细胞培养基中,最终浓度为50ng/ml,然后培养细胞48小时,直至细胞扩增至适当密度。

        M2极化:

        用完整的RPMI 1640培养基洗涤细胞,并将其在无血清RPMI 1640培养基中培养24小时。

        加入人类IL-4和IL-13,最终浓度分别为20ng/ml,然后继续培养24-48小时。

        收集细胞,进行流式细胞分析或Western blot等实验。

        注意事项:

        实验前请确定使用的抗体已经充分验证并在文献中得到验证。

        在整个实验过程中,请保持细胞在恒定的体外条件下。

        不同的细胞系可能对不同的生长因子和细胞因子有不同的反应,因此最好进行多次实验并根据实验结果进行优化。

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