在Assay中选择Absolute Quantification后，溶解曲线怎么设置呢？

绝对定量是适合需要测定靶点实际拷贝数的研究人员采用 的实时荧光定量 PCR 分析方法。要进行绝对定量，需对 已知浓度的目标模板溶液进行几次连续稀释，采用实时荧 光定量 PCR 扩增，利用获得的数据生成标准曲线，标准 曲线以各靶点浓度及相应的 Ct 值绘制。然后将未知样本 的 Ct 值与此标准曲线进行比较，确定其拷贝数。

而溶解曲线是看引物特不特异的，按照常用的方法设置就好。①快速升温至 95℃，将反应体系中的模 板双链 DNA 全部变为单链 DNA，Analysis Mode 设置为 None，时间 20 秒，Ramp rate 4.4℃/s；②将 PCR 反应体系温度冷却至目标 DNA 的退火温度以下，系统默 认值为 65℃，Analysis Mode 设置为 None，时间 30 秒，Ramp rate 2.2℃/s；③将 反应体系温度缓慢升至 95℃，Analysis Mode 设置为 Continuous， Ramp rate 0.06℃ /s

溶解曲线怎么设置，普通PCR的扩增产物通过电泳跑胶的方式来区分目的产物和非目的产物（引物二聚体、非特异性扩增产物）。

而且当从高浓度到低浓度做梯度实验时，我们从电泳图上往往可以看到3个结果：

1 全部目的产物

2 部分目的产物，部分非特异产物（比目的产物大或者小）

3 全部非特异产物

荧光染料是DNA双链小沟结合物，本身不具有选择性，能和所有的DNA双链结合。

在荧光PCR染料法里，我们单单通过PCR荧光扩增曲线来“判断”结果是否合适？

显然，单从荧光扩增曲线来“判断”结果是不合适的。

因为，非特异性扩增产物也能与染料结合，S型的荧光扩增曲线中有局部or全部的荧光来自非特异扩增的“贡献”。

鉴定并区分目的产物与非特异产物

显然，需要通过溶解曲线。

双链DNA都有自己的Tm值。可以通过Tm值的不同，将不同的产物分开。

在荧光PCR中，大多扩增100bp左右的产物（最好不超过200bp），退火和延伸时间较短。非特异的产物基本上都比目的扩增片段小。

所以，在做溶解曲线分析时，目的片段的Tm值较大，而非特异的Tm值较小。

二 降温速率

普通荧光PCR仪的降温速度默认是：1℃/cycle，能做HRM的仪器，降温速度可设置为<1℃/cycle。

一般来说，不做HRM，就设置1℃/cycle即可满足需要。

三 温度区间

理论上来说，能包含住产物Tm值和非特异产物Tm值即可。

所以，一般设置在50℃-95℃区间内均可。

四 荧光采集时间

若出于节省时间的考虑，用5s都可以有比较不错的结果。