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科研学霸天团，48小时有问必答

问内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？

赵栋2012

1. 一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10 min 左右；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30 min。2. 用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。3.现用现配，配好后4℃避光保存。

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问一抗 4℃ 孵育后为什么要进行 37℃ 复温？

赵栋2012

1. 一方面，防止切片从4℃直接放入PBS易脱片。2. 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4℃和37℃时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

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问免疫组化中的血清封闭原理？

tao0129

封闭血清的原理主要有两点。第一是待检样本会非特异性的和蛋白结合，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。

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问补体测定实验中，用到的胎牛血清需要灭活吗？

游刃有余-xiaobao

需要的，补体结合实验需要灭活，最好是活性炭过滤血清

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问苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长?

赵栋2012

返蓝可以用碱性溶液（PBS/Na2HPO4/淡氨水）或45℃温水、冷水蓝化均可。一般蓝化5~10 min。淡氨水有人用50 ml 自来水＋三四滴的氢氧化铵。

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问谁做过免疫细胞化学？

sunny218

将盖玻片用75%的酒精浸泡后，烤干酒精，再放入培养皿中，直接将细胞种到盖玻片上就好。

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问在什么情况下使用TritonX-100？

苹果嘿嘿

核染时使用

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问免疫组化结果如何分析？

赵栋2012

1. 阳性着色细胞计数法。在40×光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。2.灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。3.评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（

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问如何把握 DAB 的显色时间？

赵栋2012

1. DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗。2. DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间。3. 此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间。4. DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能

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问石蜡切片和冰冻切片的比较？

tao0129

1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。2. 冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果

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问封闭血清的选择原则是什么？

tao0129

1.膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性。2.封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。3. 也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

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问如何把握苏木素复染时间？

tao0129

1. 苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。2.; 盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。3. 如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。

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问如何区分组织切片中不同种类的细胞，可以用标记方法区分吗？如可以，具体怎么操作？

chahaoran

HE 染色，大致区分，可从形态看出一些。比如，淋巴细胞，核大，核浆比大，核上有个小缺口。等等，组织学上有的。免疫组化技术，免疫荧光技术，可通过特异的表面分子标记来区分。

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问肝细胞膜蛋白的免疫组化需要注意点什么呀？

gynju

免疫组化关键还是抗原的修复和一抗是否好用，曾经做出来过应该是没有问题的。DAB显色是需要在显微镜下观察的，有的时候非常快的，几十秒都可能出来，建议可以每次多做一张片子，把它放在显微镜下调好焦距然后再滴加DAB，同时记录时间，然后按时间做其它的片子。

1 回答2810 围观

问如何确定细胞上清液的待测浓度是否在 ELISA 试剂盒的检测范围内？

小新的铅笔

做预实验，把样本稀释成不同倍数做预实验，从而确定正式实验的样本稀释倍数。

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问细胞免疫荧光中 Alexa Fluor488 二抗在镜检中曝光时间是多少？

huangyusheng

好像300~800毫秒

1 回答1957 围观

问Elisa 标本重复冻融使用会影响结果吗？

我是金博士

一般来说，标本拿出后再放回去次日做，效果肯定会有点影响，至于降解应该没那么快。但你标本为啥不分装呢？每次用一支或一管。用完就不要了，就没有这个问题了呀。

1 回答1337 围观

问冰冻切片免疫双染的背景问题

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问Herceptin 发酵后为什么抗体碱峰过高？

1204 围观

问神经肌肉接头部位运动终板的显色

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