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        磷酸化蛋白质组在过柱富集分析等步骤后,怎么确定蛋白的磷酸化位点的?

        相关实验:磷酸化位点分析实验-磷酸化位点的确定

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        dxy_a413qe92


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        1 个回答

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        百泰派克-李工

        有帮助

        质谱技术是确定蛋白磷酸化位点的重要工具,在磷酸化蛋白质过柱富集分析后,接下来的实验流程如下:

        1、蛋白质消化

        将富集的磷酸化蛋白质用特定的蛋白酶(如胰蛋白酶)消化成较小的肽段。

        2、磷酸化肽段富集

        使用特定的亲和层析技术(如IMAC或TiO2)来富集磷酸化的肽段。这些富集方法能够特异性地结合磷酸化肽段,从而使其从非磷酸化肽段中分离出来。

        3、质谱分析

        将富集得到的磷酸化肽段进行质谱分析,最常见的是使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)。这种方法能够精确地鉴定出肽段的质量和序列,包括磷酸化位点。

        4、数据分析和位点确定

        质谱数据分析是鉴定磷酸化位点的关键步骤。使用专门的生物信息学工具和数据库,如Mascot、PhosphoRS或MaxQuant,来分析质谱数据。这些工具能够识别肽段序列,并确定磷酸化发生的具体氨基酸残基(通常是丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)。

        5、验证实验

        一旦磷酸化位点被确定,例如使用磷酸化特异性抗体进行免疫印迹(Western Blot)分析。


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