磷酸化位点分析实验-磷酸化位点的确定

过去确定磷酸化位点测序最常用的是逐步化学降解法，如丝氨酸和苏氨酸磷酸化分析方法、酪氨酸磷酸化分析方法, 最近，此方法已经主要被质谱方法所取代 。非放射活性和放射活性磷酸肽测序的方法，这两种方法可以补充．在某些情况下可以替代质谱方法来确定磷酸化位点。非放射活性方法是用于检测磷酸丝氨酸和磷酸苏氨胺，包括β-消除，与巯基乙醇反应形成s- 乙基化半胱氨酸或β-甲基-s-乙基半胱氨酸，它们很容易以 PTH

下面讲的 MS 扫描方式，已经成功用于磷酸肽的分析。总之，在不能掺入32p或标记物已经衰变到检测限以下的情况下．产生磷酸盐特异离子（例如一个诊断离子）的方法是很有用的。如果希望的话这种扫描模式也能用于分析放射性标记的磷酸肽，因为由放射性同位素磷酸盐对磷酸肽贡献的质量非常小，可忽略不计。需要注意的是，虽然有人担心质谱仪会被 32p样品污染．但这种可能性可以避免，只要在质谱实验之前等侯足够数量的半衰期

这种实验在 MALDI-TOF质谱仪上进行。在 single-stage型仪器中．通过观察亚稳裂解提供肽段序列信息。这一方法已成功用于磷酸肽的序列分析。

这种方法得到特别关注、但它能提供磷酸肽中磷酸化氨基酸的定位，可以在非磷酸肽占主导地位的混合物中鉴别磷酸肽，此方法使用的是磷酸酶 。用简单的 MALDI-TOF仪器就可以得到磷酸化蛋白水解后产生肽段的质量，同样的样品用磷酸酶处理后，除去了丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸上的磷酸，再分析其质量。任一个减少了 80u 的质量数，都将预示着这一肽段被磷酸化了。MALDI 做这一实验的优点是产生的肽段离子更倾向于单质