蛋白质分子量很小，怎么做wb？ 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot 试验吗?做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗?

可以使用WB或者PCR验证一下，也可以搜索相关文献基础，小分子的WB需要减少转膜时间。

蛋白质分子量确实很小，但在Western blot（WB）实验中，我们检测的不是游离的蛋白质，而是蛋白质在SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）过程中形成的蛋白质复合物。这些复合物中含有蛋白质和SDS，形成的复合物足够大，能被Western blot检测到。

要验证某个细胞上是否存在特定蛋白质，可以使用免疫组化（IHC）和Western blot（WB）试验。免疫组化是检测蛋白质在细胞内的定位和表达，而Western blot是检测细胞或组织样本中的蛋白质表达水平。这两种方法可以互补，提供更全面的信息。

关于一抗和二抗的问题，在一定条件下，免疫组化和Western blot的一抗和二抗可以共用。需要满足以下条件：

1. 抗原-抗体反应的原理相同。如果两个试验的抗原-抗体反应原理相同，那么一抗和二抗可以共用。

2. 试验的条件相似。免疫组化和Western blot的试验条件有所不同，例如抗体的浓度、反应时间、温度等。在这些条件相似的情况下，一抗和二抗可以共用。

3. 二抗与一抗之间的交叉反应不产生干扰。在选择共用的一抗和二抗时，需要确保它们之间的交叉反应不会对实验结果产生干扰。

一、上样量

通常Western Blot每孔上样量为30-50μg，80%蛋白在细胞中的含量很低，当蛋白分子量过小时，上样量建议选择50-100μg。毕竟对 于小分子的蛋白来说，在跑电泳时，稍不留心，蛋白就跑没影了。

二、凝胶电泳

1.选择合适胶浓度。分子量小的蛋白，建议配置5%的浓缩胶，分离胶浓度参考下表。

分子量（kDa) 分离胶浓度

X≤10 15%

10 13.5%

15 12%

2.电泳电压太大会导致跑在最前面的小分子蛋白成锯齿状，建议浓缩胶用80V 30分钟，之后调成100V, 溴酚蓝跑到距胶底1cm以上就停下，不要跑到底，否则目的蛋白可能跑出去了。

三、转模

1.膜的选择。免疫印迹中常用的固相材料有 NC 膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF 膜等。推荐选用 PVDF 膜（聚偏二氟乙稀），因为蛋白质与 PVDF 膜以疏水力结合，从而将亲水部位暴露到液相，使抗体更容易与之结合。

四、转膜后用丽春红染色，测定蛋白丰度。

PVDF膜经丽春红染色后，可以检测出样品电泳过程中呈现印迹的大小，通过各个泳道上样品印迹的对比，可以初步判断上样量的准确性。

五、一抗的稀释比例。

通常抗体的说明书上都会给出一定的稀释比例对于分子量过小的蛋白来说，一抗应选择低的稀释比例，这样有助于抗体的结合。

六、显影要把握曝光时间。

根据信号的强弱适当调整曝光时间，如果在暗处马上可以看到条带，建议曝光时间在30s-2min内完成，如果信号较弱，第一遍滴加显影液后条带不会很清晰，可以把膜拿出来放一边让它反应一会，然后再放回机器里面，重新滴加显影液显影，效果就会好不少。还有适当延长显影时间，就能获得清晰的条带。

一抗是可以共用的，主要还是看你的抗体是否可以同时做免疫组化和wb。分子量小注意用0.2的膜然后小分子的胶就可以

小于15的蛋白用15%以上的分离胶，一般用wb做相对定量，组画或荧光做定位，一抗看说明书，有些通用，二抗是不通用的