小分子蛋白（15kd）wb跑不出，且在15kd附近一团阴影？

我觉得还是有杂质的，你可能要精炼一下蛋白，然后跑胶的时候时间稍微长一点，如果还是不行，就建议配胶的浓度变大一点试试。

考虑以下几点原因及处理建议:

1、蛋白降解；对策：于冰上提取，buffer 里加蛋白酶抑制剂防止降解。

2、样品保存不当；对策：提取后尽快测定浓度，

并煮沸变性，未煮沸样品保存置于 -80 ℃ 保存。

3、胶浓度较低，容易跑过头；对策：换用浓度较高的胶，例如 15% 或者用梯度胶。

4、转膜时间太长，小分子蛋白转过头；对策：减少转膜时间，可尝试 200-250 mA 转 15-30 min 左右。

5、膜孔径太大；对策：换用小孔径如 0.2 μm 的 PVDF 膜。

6、running buffer 不合适；对策：换用 Tricine-Glycine。

7、抗体特异性不佳或失效等其他原因；对策：参考文献选择合适的抗体更换。

提高一下分离胶浓度，考虑是分离胶浓度太低导致的小分子跑不出结果

可能是由于几种原因造成的：

1. 蛋白负荷过高：如果在电泳过程中加载的蛋白负荷过多，特别是在目标蛋白质的分子量范围周围，可能会导致条带过于密集和模糊，难以区分。尝试减少加载量可能有助于解决这个问题。

2. 转移条件不当：不正确的转膜条件可能导致条带模糊和重叠。过高的电流或时间可能会导致蛋白质在凝胶中迁移得太快，使得特定的条带无法清晰分离。你可以尝试调整转膜条件，例如减少电流或转膜时间，以获得更好的结果。

3. 凝胶浓度选择：选择合适的凝胶浓度可以影响蛋白质的分离。对于较小的蛋白质，使用较高的凝胶浓度可能有助于提高分辨率和条带清晰度。

4. 蛋白质结构和交联：某些蛋白质具有自身的特殊结构或交联状态，可能导致它们在电泳过程中以不寻常的方式迁移，从而形成模糊的条带。这可能需要进一步的优化和调整来解决。

抗体的特异性不好再加上蛋白表达量低就会这样。可以增加上样量，明确蛋白的大小位置，显影的时候截去大部分多余的位置，这样可以提高目标位置的显影效果。