磷酸化的p-PI3K条带好淡，怎么才能跑出好的条带呢？

因为磷酸化蛋白只占总蛋白量的极少部分，加入一抗后最好4℃过夜，保证抗体有充分的结合时间。4℃也可以使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化抗体都挺贵的。二抗则室温1h即可。4℃过夜，主要原因不是使抗体结合更好，而是蛋白抗原不容易从膜上脱落。蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附属热力学范畴，高温下容易脱落。

磷酸化蛋白WB时，用洗涤液漂洗时也要注意一下，摇床的转速不要太快，洗的时间不要太长，孵育一抗和二抗之后分别洗3次，每次5min即可。宁愿深一些，总比做不出来强得多。另外，洗的时候，最好不要把几张膜叠在一起洗。

条带淡的话建议增加上样量，可以获得美观的条带

条带淡可能是本身表达就低，可以适当增加蛋白上样量。