求教 奇奇怪怪的WB

有以下几点原因：

①预处理时未将膜完全均匀地浸透

PVDF膜使用前要用100%甲醇浸透膜；有些NC膜需要甲醇浸湿，而有些NC膜不需要甲醇处理，只需要用转膜buffer浸透，具体根据所购买的NC膜说明书操作。②靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液(pH10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液。

③甲醇浓度过高

过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。

④SDS浓度不够

转移大于100KDa的蛋白时，需要在Western转膜液中加入适量SDS。

⑤转移时间不够

对较厚的胶以及大蛋白需要延长转移时间。

可能是由于转膜不均匀导致的。您可以尝试调整电泳条件或者更换转膜膜，以获得更好的转膜效果。另外，您也可以考虑使用标记另一种蛋白质的探针或者荧光素做内参来确定蛋白质的相对表达量，以排除转膜问题的影响。

第一条还是抗体的问题。抗体特异度差。