ELISA 实验求助|阴性血清和阳性血清OD值差距不大怎么办

我们采用的间接法做ELISA，自己纯化的抗原去包被板子，没有标曲，没有用试剂盒，阴性血清和阳性血清OD值差距不大，请各路大神赐教。

包被浓度从5ug/ml-1pg/ml，血清稀释从1:50-1:1000，都试了差距不大。封闭液试过1%BSA、5%BSA背景值很高，换了0.5%络蛋白、5%络蛋白背景值降低。但是阴性血清和阳性血清差距都不大。

我们的步骤：①：抗原包被：4度过夜孵育，包被液用的是50M碳酸氢钠，PH=9.6；②洗板机1X PBST清洗4次，0.5%络蛋白37度封闭2h；③洗板机1X PBST清洗4次，血清4度过夜孵育，血清稀释用的是0.5%络蛋白；④洗板机1X PBST清洗4次，二抗37度孵育1h，二抗稀释用的是0.5%络蛋白；⑤TMB显色液显色，5min后终止液终止。

下面是ELISA OD值的结果，请各位大神赐教啊 。