800MS曝光以后看到背景很杂连对照也有杂背景，红框的是对照，这是什么原因呢？

这还算可以，主要就是抗体的非特异性结合。可以延长封闭时间，室温2-3h，另外抗体可以用5%BSA或者脱脂牛奶来配制

有可能是以下的环节出了问题：

1、实验准备

提取蛋白所需的研磨器材，以及制胶的玻璃板、梳子要清洗干净;若长期不使用，建议器材在实验前再行清洗一次以杜绝相应的污染。

2、提取蛋白

选择合适的蛋白裂解液，充分去除一些干扰因素，比如核酸，多糖，脂类等;建议蛋白在测量浓度后变性分装保存，避免反复冻融使蛋白发生降解;注意 Loading buffer 在保质期内，蛋白加入 Loading buffer 后充分混匀，再煮沸变性。

3、制胶

玻璃板夹紧之后，有些人习惯性加水试一下是否漏胶，建议用蒸馏水而不是自来水测试，测试结束后要将玻璃板之间的水倒干净，用滤纸吸干残留的水；灌胶之前要将配好的试剂充分混匀，灌胶的过程中要掌握好速度，缓慢加入，避免产生气泡；灌注好分离胶后，缓缓加入无水乙醇封胶，该步操作时速度一定要慢，防止胶面被冲变形；在等待分离胶凝固的过程中，不要总去摇晃观察；温度较高的情况下，30 min 左右就会凝固，冬天气温较低可能需要较长时间；若分离胶液面不平，会影响后期蛋白电泳的效果。

4、转膜

转膜前需在转膜板两侧各放置 3 至 4 张滤纸(两侧数量相同)；切记不要用手直接接触 PVDF 膜和滤纸，手上的油脂会对其造成污染，务必佩戴干净的手套，全程尽量使用镊子夹取；转膜过程中海绵-滤纸-凝胶-PVDF 膜-滤纸-海绵每一层的气泡要排空；转膜时要使整个电转仪置于冰水混合物中，常用 220 V 或者其他高电压进行；机器温度升高，会使蛋白降解，也就是转膜后，用丽春红染色发现条带跑糊，发光后条带和背景也会脏的一塌糊涂。

5、孵育抗体

孵育一抗的时间大多会选择 4 ℃过夜，也可以室温封闭 2 小时，4 ℃ 过夜效果会比室温好，4 ℃ 过夜具体多长时间算合适，其实没有硬性规定；二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育 1 到 2 小时，抗体孵育完成后要清洗干净，特别是二抗孵育完成后，否则可能导致显影结果出现高背景。

6、发光液配置

大部分实验室使用的 ECL 发光液，A 液和 B 液按照 1：1 的比例配置；发光液要求现用现配，每次根据使用量合理配置用液量；发光液配置时间过长同样会引起发光效果不好，背景脏或者漆黑一片。

抗体特异性不高造成非特异性结合的原因。