WB看不到条带？

最近在做GFAP，抗体是碧云天的，样品是脑组织全蛋白。做了两次，第一次是想看看样品能不能用，所以，就过夜封闭，一抗室温孵育3小时，能看到条带；第二次是一抗过夜，却看不到条带。不知道怎么回事？下图是从70KD到15KD的膜，第一条淡一些的是GFAP，中间亮的是GAPDH，下面的是杂带。一抗是GFAP和GAPDH抗体一起孵育的。