内参一直就几个样本条带清晰明显？

1、我最近两星期做WESTERN BLOT 12%分离胶MAKE在25和35KD处老是跑不开，其他的都分得很开（做了半年的western blot 以前都没遇见这种问题），各种原因尝试，重新配试剂、换MAKE、制胶时充分摇匀、重提蛋白、重变性等。考马斯亮蓝染色发现发部分蛋白提留在积层胶与分离胶分界的位置，分子量为17KD的目的蛋白发出来了，actin发不出来。2、后来我换10%分离胶，make跑得不错，我的目的蛋白发光很好，但是我的内参一直就几个样本条带清晰明显，另几个蛋白就一点条带都没有，已经连续三次这样了，不存在蛋白降解。请问是什么原因呢？头疼啊。。