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问
动物实验 WB 标本数量如何选择?为什么?
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问
谷胱甘肽标签蛋白包涵体纯化方法?
一乐到底
我也是使用GST标签蛋白,用全式金蛋白纯化方法,试剂盒要求过柱纯化前先变性再复性,在尿素透析复性过程中一直出现沉淀,请问怎么解决
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问
western Blot 检测心肌中,模型大鼠处死后取心肌组织,怎样提取细胞蛋白?
fmmuzhangfuyang
1.大鼠处死后剪取心脏,迅速用4摄氏度预冷PBS洗净血液,液氮速冻后移置负80摄氏度冰箱冻存2.提取时按照每毫克组织加入100ulRIPA裂解液,然后机械匀浆,12000r/min离心抽取上清,按照体积比1:4加入5乘loading buffer,95度10min,即可用于WB检测3.其余无特殊按照WB步骤进行
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问
为什么一定要加內参?有的样品里如尿液中蛋白分析无合适內参怎么办?
alaling
加入内参是为了消除外部操作产生的差异。比如你需要加样1ul,你能保证枪加入的就一定准确的是1ul吗?枪尖随便挂个0.1ul和不挂,差别就有10%。尿液里的蛋白如果没有合适的内参,可以考虑以添加外参的方式进行,就是在每个样品里面添加已知量的某种纯蛋白。当然,如果用纯体积或纯样品量进行参比也是可以的。最重要的是要参考文献,看看大部分人是如何处理这种问题的。
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问
为什么 Odessy 扫描后发现有的地方有蛋白,有的就是空白一片?
应用场景
是不是有可能转膜出现了问题?
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问
分子生物学
我是金博士
这个你要查一下文献,一般会有破碎条件。然后摸索一下,就可以了。
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问
WB内参总是跑不齐
应用场景
我可能您选用的内参表达不稳定,需要换内参,或用总蛋白做内参
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4821 围观
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问
求问各大神,WB 跑出来的带子连成一条直线是怎么回事?
joson12345
样品制备的问题,如果样品粘稠的话,用全能核酸酶处理一下。
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1913 围观
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问
WB 上样量怎么计算?
论文菌
最大浓度x对应体积再➗最小浓度就是最大浓度对应的体积,然后总体积再减去当前体积,等于需要稀释的体积。
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6976 围观
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问
封闭液的机理?
我是金博士
根据的就是相似相溶,不相似不相溶,封闭液,一般选异丁醇,实在不行,也可选乙醇。
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1151 围观
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问
为什么膜需要减成多段?
鹏21PE
不同蛋白大小不同,膜剪成多段可以同时孵育多种抗体。
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748 围观
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问
我用的预染marker,转膜时发现完全没有转到膜上,但是胶上也没有marker,这是什么原因呢?
我是金博士
1、这个正常,转膜结果到底如何需要染膜来看膜上的蛋白 2、不能这样来确定 3、这个很奇怪,没碰到,看看你做的三明治是否成功,仪器是否有问题 4、与电压之类是有关系,但是不应该2个泳道的marker,一好一坏
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6312 围观
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问
请问 SDS-PAGE 实验中出现拖尾的现象是什么原因?
极客医生
marker很清晰,胶应该是没有问题的。样品有问题,可能是蛋白样品发生降解,在上样之前,要把蛋白样品在100度煮几分钟,变性失活。同时改变一下上样量,一次性不要太多。用新鲜样品,最好现煮现跑。
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5875 围观
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问
半干转是否要求膜,滤纸,胶同样大小?
tao0129
可以相等,但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了,上下两层虑纸也不能因过大而相互接触,这样同样会短路,电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行,正常的半干是慢慢变高的, 最后结束时一般是开始的1.5~3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。
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问
使用磁珠拉蛋白,会不会使蛋白彻底降解掉?
wyf-525
有就是有,没有就是没有,我们实验室很多人都用不加抑制剂的裂解液洗,只要你的速度赶上蛋白变性的速度就行。
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1383 围观
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问
山羊抗人的单克隆抗体可以直接注射到小鼠体内吗?
我是金博士
山羊抗人的单克隆抗体,这个是二抗,主要用来结合一抗的,跟你描述的不一样。
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2653 围观
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问
虽然阳性样品能染出条带,但以前阳性质粒也没做出来,可能不会是转膜时间问题?
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问
枯草芽孢杆菌接种总是污染,怎么办
极客医生
把不带抗性的LB plate 放在超净台里,打开超净台风扇,30min后取出LB plate过夜培养,次日查看菌落数目,若大于2则说明超净台有问题,是污染源。
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问
关于封闭,转膜后封闭,不会影响目标蛋白与一抗结合吗?
鹏21PE
1、封闭液蛋白一般是牛乳清蛋白或牛血清蛋白,目标蛋白和一抗种属均不是牛或不抗牛蛋白时,封闭液蛋白不与目标蛋白或一抗发生结合反应; 2、封闭液蛋白只结合于膜上没有任何蛋白的区域,避免一抗与膜结合。
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问
WB做出来总是有杂带并且mmp-2带很细很细背景很高很高不知如何处理?
我是金博士
如果杂带不影响主带就没问题,WB中没有杂带的情况是很少的。
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