问一下各位老师，关于PCR实验生物重复性的问题，就是最近重复不出来之前的结果，出现的趋势和之前的不一样，这有些什么原因啊?

那就要看看上样量和实验温度，如果不行就要看看具体样本情况的，最好再做样本的

样本个体差异造成不同；样本的处理不同；RNA降解等影响，反转录效率差异

可能跟加样不准确或温度条件不一致造成

可能与以下因素有关：使用的引物探针是否正确、性能是否正常、加入的模板的质量、使用的程序

1）PCR体系：一定要保证每种成分量的准确性。有些实验之所以不能重复结果，很大一部分原因是由于加样的问题。所以我觉得在配制PCR体系上要保证几ul就是几ul，量要准确。

2）基因：你做的是不同样品的同源基因是吧，而有些同源基因在不同样品之间的保守性会有差异，因此可能会导致用相同的引物扩时，重复性不好；“ 而在这些样品中其他基因的重复性都可以” 这可能是其他基因在不同样品中的保守性更高一点建议，首先保证PCR体系量的准确性的情况下，看看有没有重复性，如果还是不能重复，那可能就是第二种情况，这样的话，建议一定要保管好已做出的PCR的产物，及时做连接，转化等后续工作，以免降解。或者就查它们的同源基因比对，试着改变一下引物的序列，

这样会比较费时费力的。

样本是之前的还是重新提取的，要是之前的话很可能是降解了

影响PCR结果重复性的因素，除了加样的准确性和实验所选用的仪器固定参数的限制之外，还包括： 1.PCR 反应扩增的效率，如果在反应体系中扩增效率不一致，就会影响到目的基因在单位时间内的产量发生差异，从而影响到结果的稳定，要解决这个问题，必须尽量优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率。

2.目的基因的初始浓度，初始拷贝数越低，结果的重复性越差，为了保证获得精确的结果，应使用初始浓度具有较高数量级的样本，如果待测样本中目的基因的量处于反应体系的检出限附近，那么最好是使用复孔以保证结果的可靠性。

3.标准曲线的影响，对于必须进行绝对定量的研究，标准曲线是必不可少的，虽然标准品和样本之间的差异始终存在，但是制作一个好的标准曲线对定量结果至关重要，在制作标准曲线时，应至少选择5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围，理想的标准品应与样本具有高同源性，最好是选择纯化的质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA（用于RT-PCR），在制备过程中，应使用规范的步骤或是根据所购买的试剂盒提供的标准操作手册进行。

PCR实验的生物重复性问题可能由多种原因引起，包括以下几点：

1. 实验条件的变化：PCR实验的重复性受到实验条件的稳定性影响。任何实验条件的变化，如温度、时间、试剂批次等，都可能影响PCR反应的结果。确保在每次实验中使用相同的试剂和仪器，并且严格控制实验条件的稳定性。

2. 引物和模板的质量：PCR反应的引物和模板的质量也会对重复性产生影响。如果引物或模板存在污染、降解或稀释问题，可能导致PCR反应的结果不一致。确保使用高质量的引物和模板，并遵循适当的提取和储存方法。

3. 操作技术的差异：PCR实验的重复性还受到操作技术的差异影响。不同的实验者在操作过程中可能会有微小的差异，例如反应管的混匀程度、PCR反应体系的配制等。确保操作技术的一致性，尽量由同一实验者进行实验，并且遵循标准化的操作步骤。

4. PCR抑制物质的存在：有时，样品中可能存在PCR抑制物质，如血液中的抗凝剂、细胞组织中的多酚类化合物等。这些抑制物质可能会影响PCR反应的效率和特异性。在PCR实验中，可以通过进行样品稀释、纯化或添加PCR抑制物检测剂等方法来排除抑制物质的干扰。

5. 统计变异：PCR实验的结果可能受到统计变异的影响。PCR反应是一种高度敏感的方法，微小的变化可能会引起结果的差异。因此，对于PCR实验的结果，应考虑进行多次重复实验并进行统计分析，以确定结果的可靠性。

综上所述，PCR实验的生物重复性问题可能由多种因素引起。为了提高重复性，需要注意实验条件的稳定性、引物和模板的质量、操作技术的一致性以及PCR抑制物质的排除等方面的控制。同时，进行多次重复实验并进行统计分析也是确定结果可靠性的重要手段。

我感觉基因表达本来就是一个动态变化的过程，细胞有正反馈也会有负反馈，就比如外面炎症刺激后，细胞在一段时间内会出现炎症因子表达升高现象，但是细胞的自己调节会在一定时间内出现下降的趋势。

同时有些基因的表达受细胞密度影响很大。

PCR实验重复性差异的原因可能包括以下几个方面：

1. 实验条件变化：PCR实验对实验条件的稳定性要求较高。即使微小的实验条件变化，例如反应体系组分的浓度、温度、循环数等，都可能影响PCR扩增的结果。确保实验条件的一致性非常重要，包括使用相同的试剂批次、准确的体积测量和温度控制等。

2. 样本质量差异：PCR实验的结果可能会受到样本质量的影响。如果样品的质量不稳定，例如RNA或DNA的降解、污染或浓度变化，都可能导致PCR结果的不一致性。确保样本的一致性和质量稳定性，例如适当的保存和提取方法，以及质检步骤，可以减少这种影响。

3. 污染和异质性：PCR实验中的污染和异质性也可能导致结果差异。污染源包括空气中的DNA、外源性DNA污染、试剂污染等。此外，样本中存在的异质性，例如细胞类型的差异或突变的存在，也可能导致PCR结果的变异性。适当的实验设计和样本处理步骤可以帮助减少这些影响。

4. 技术变异：PCR实验本身存在一定的技术变异性。例如，反应管中的体积差异、酶的活性差异、PCR仪的性能差异等，都可能对结果产生影响。确保在实验中使用标准化的技术操作和设备可以减少这些变异。

5. 统计差异：PCR结果的分析和解读也需要考虑统计学上的差异。结果的变异可能是符合统计学上的随机误差，而非真正的实验条件变化所致。在进行结果解读时，应考虑到统计学上的显著性和可信区间等指标。

所以，PCR实验重复性差异可能源于实验条件的变化、样本质量差异、污染和异质性、技术变异以及统计差异等多种因素。为了提高PCR实验的重复性，建议注意实验条件的一致性、样本质量的稳定性、污染和异质性的控制，以及标准化的技术操作和统计分析。

① 移液枪不准，加样不准确

这种情况下，我们可以更换性能更好的移液枪，扩大反应体积，将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中。

② 定量PCR仪在不同位置温度不一样

这个需要定期校准定量PCR仪。

③ qPCR预混液未混合均匀

使用前应充分混匀qPCR预混液。

可能是上样量的差异或者样本存在降解

一般要先看你的引物设计有没有问题,可以多设计几条引物序列

整个PCR的体系有没有问题,都要重新梳理,核对,如果试剂有问题的话就重新更换;怀疑目的基因上下游序列有问题,可以多设计几条。

样本处理不对，没有处理好或者处理是对的但是加样失误

(1) 加样不准确。

(2) 仪器在样品上温度条件有差异, 即温度均一性不好.

(3) 模板浓度低. 样品初始浓度越低, 重复性越差, 应减少样品的稀释倍数.

1. 样本处理与取材

取材不严格，基因表达往往是有时空特异性的，同一处理下不同的样本取材部位或取材时间不一致会导致检测结果差异很大

供试材料生长不一或者生物学重复之间处理不一致。

2.RNA质量

 RNA不同程度降解，导致重复性很差。

提取的RNA有不同程度基因组残留，基因组扩增影响了真实结果

提取的RNA有不同程度抑制剂残留，抑制了后续的PCR反应

3.反转录

反转录反应体系不同样本模板上样量差异大，造成反转录效率有差异影响了后续结果。

4. 样本个体差异

不同的生物个体之间受环境遗传等因素影响会有不同程度的系统误差，对于差异大的个体生物学重复性也会较差。