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        pcr扩增产物出现杂带怎么办?

        相关实验:单分子 PCR

        user-title

        上进__

        pcr扩增产物电泳出现问题

        求助,pcr扩增产物电泳,目的片段218bp,

        pcr程序退火温度59°,延伸时间20s,35个循环,结果出来了三个条带,2000bp的Marker,胶浓度3%,用的TBE,1-9是不同的DNA样,最后一个胶孔是阴性对照,为啥出现了两条杂带,还有为啥胶孔里那么亮图片描述##

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        4 个回答

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        引物设计不合理

          引物是PCR扩增反应中的重要组成部分,引物的选择和设计对PCR扩增的特异性和准确性有很大的影响。如果引物的设计不合理,可能会导致扩增产物出现杂带。例如,引物长度过短、引物的序列重复、引物的序列含有多个GC或AT碱基等都可能导致PCR扩增产物出现杂带。

          解决方法:重新设计引物,确保引物的长度适当、序列不重复、GC含量和AT含量适中,并使用专业的引物设计软件进行设计。

          模板DNA的污染或降解

          PCR扩增的模板DNA是PCR反应中的关键组成部分,如果模板DNA受到污染或降解,可能会导致扩增产物出现杂带。例如,模板DNA可能受到细菌、真菌、病毒等微生物的污染,或者在提取、保存和运输过程中受到降解。

          解决方法:使用高质量的模板DNA,并严格控制模板DNA的提取、保存和运输过程。在实验过程中,使用负对照和阳性对照,以确保扩增产物的特异性和准确性。

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        存在以下几个可能的原因:

        1. 异源DNA污染:杂带可能是由于实验室环境中的异源DNA污染导致的。这可能来自之前的PCR反应产物、试剂或实验室工作区域中的DNA。在进行PCR反应前,确保所有实验材料和试剂是无污染的,并使用专门设计的PCR工作区域和工具。

        2. 非特异扩增:杂带可能是由于非特异扩增引起的,这意味着在PCR反应中扩增了除目标片段外的其他DNA片段。这可能是由于引物的非特异性或PCR反应条件的不适当所导致的。尝试优化引物的设计、优化PCR反应条件(如退火温度和延伸时间)以提高特异性。

        3. DNA降解或异构体形成:杂带也可能是由于PCR产物的降解或形成了异构体所导致的。确保使用新鲜的DNA模板,并在扩增后及时处理PCR产物以避免降解。此外,检查PCR反应条件是否适当,以防止异构体形成。

        4. 胶孔亮度:明亮的胶孔可能是由于胶浓度、电泳条件或染色剂使用不当所导致的。确保在电泳之前准备好的凝胶浓度适当,并根据说明书使用正确的染色剂浓度。此外,检查电泳条件是否正确设置,以确保合适的电场强度和电泳时间。

        如果出现这些问题,建议尝试以下方法:

        • 清洗实验室工作区域和仪器,以避免异源DNA污染。

        • 优化引物设计和PCR反应条件,以提高特异性。

        • 确保使用新鲜的DNA模板,并及时处理PCR产物。

        • 检查胶浓度、电泳条件和染色剂的使用是否正确。

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        huarenqiang5

        有帮助

        可能的原因和对应的解决方案如下:

        1.引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

        2.循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。

        3.酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。

        4.退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的 PCR 扩增。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。

        user-title

        dxyc42u

        有帮助

        考虑是非特性扩增,建议重新设计引物

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