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各位大佬们救命,已经快要癫掉了,最近在做pcr实验,发现自己的目标产物片段有些扩不出来,有些非目标条带比目标条带还亮,温度升高或降低都试过了还是不行,该怎么办呢?
marker最亮的条带是400bp,往下依次是300、200bp
我的目标片段分别是235bp和345bp
左边10个孔分别是两个不一样的样本,目标产物大小是235bp
右边5个孔是同个样本,目标产物大小是345bp
z流沙z
这都是非特异性的条带。如果有目的条带还行,可以升高退火温度以减少非特异性条带。但如果都没有目的条带,引物基本不行了。虽然是参照文献,但也不一定好用,应该去ncbi上面blast一下以保证引物的特异性。
土井挞克树
更换引物吧,这是引物适配度差导致的
loveliufudan
首先,非目标条带比目标条带亮的可能原因是PCR反应出现了非特异性扩增或者非特异性结合。为了解决这个问题,可以尝试以下措施:
优化PCR反应条件,包括试剂浓度、PCR程序、退火温度和退火时间等。
更换引物,使用设计更合适的引物。
添加热启动酶,例如Taq抗体或者热启动聚合酶,以增强PCR的特异性。
尝试降低DNA模板的浓度,以避免非特异性扩增。
其次,目标产物大小不对的可能原因有很多,比如引物设计有误、PCR反应条件不合适等。建议进行以下检查和调整:
检查引物序列是否正确,并重新设计引物。
优化PCR反应条件,包括试剂浓度、PCR程序、退火温度和退火时间等。
检查DNA模板的质量和浓度,保证充分的PCR扩增。
检查电泳条件是否正确,例如电泳电压和时间是否合适,是否加入足够的电泳缓冲液等。
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