T载和目的片段连接后提质粒用特异性引物跑PCR的问题，求大佬解答!!
dxy_fgh8mbe0
用PMD-18T载和我的目的片段174bp连接后画板做了筛选，挑单菌落在有抗性的LB扩菌后，进行了菌液PCR有目的条带而且没有杂带，但提取质粒后跑PCR有目的条带但也有杂带。重组质粒是想用来做荧光定量PCR的标准质粒的，是引物特异性不高
2 个回答
土井挞克树
更换引物，这个结果说明引物差异性太大
loveliufudan
在提取质粒后跑PCR时出现杂带，通常有几个可能的原因：
污染：可能在提取质粒的过程中，有外源性的DNA或RNA污染了样品，导致PCR时出现了杂带。你可以尝试更换提取质粒的试剂盒，或者增加样品处理过程中的洗涤步骤，以减少污染的可能性。
引物非特异性：可能PCR的引物不够特异，会引起非特异性扩增。你可以尝试优化引物的浓度和反应条件，或者设计新的引物来提高特异性。
质粒不完整：可能质粒的完整性不够好，导致PCR时扩增了不完整的质粒或质粒断片。你可以尝试使用其他方法来检测质粒的完整性，如酶切、测序等。
总之，建议你重新检查样品处理过程中的操作流程，优化PCR反应条件，重新设计引物，以及尝试其他方法来检测质粒完整性，以提高PCR反应的特异性和准确性。
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