实验问答21,935,721 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问关于探针特异性的问题

bamboopiggy

优先考虑探针位置 • 探针的5'端第一个碱基不能是G • 基因表达探针Tm值：68-70C；基因分型探针Tm值：65-67C • TaqMan探针长度13-30bp，TaqMan-MGB探针长度在13-25bp • 避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G • C比G多的探针效果更好，如果C少于G，选择其互补链 • 多态位点应尽量位于探针中央，可以±3个碱基

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问请问普通PCR和RT-qPCR大家都做吗？还是只做一种，如果两个实验结果对不上怎么办?

天一湖医者

实时定量PCR和半定量PCR结果不相同很正常，毕竟半定量PCR的误差很大，在做半定量的时候，你一定要把内参基因调的，在各个组织中表达量是一样的，这样才能做目的基因。而实时定量PCR就不存在这样的问题，所以我觉得还是你的半定量可能调的cDNA没有调好。

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问请问测提取的核酸浓度时，260/280在1.8－2.0之间，但是260/230很小，只有1.1左右，这样测出来的值可以用吗？

whilt-shirt

可以用的，主要是看浓度和260/280的值。

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问PCR的适用范围和主要针对对象是毒性实验吗

天一湖医者

不是的，PCR的适用范围和主要针对对象不仅是毒性实验，还有其他很多方向。

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问半定量PCR和定量PCR在斑马鱼这类模式生物上的类似实验自己可完成吗？还是需要专业设备

汤姆卜丽波

就和其他生物一样操作就可以了，组织取核酸，不需要专业设备

4 回答229 围观

问请问引物设计大家都是怎么做的呀？我看有公司设计的有自己设计的，那可以用文章里的引物序列吗？

whilt-shirt

可以用primer bank，也可以用文章里面的，但是会有问题

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问我想问下关于circRNA环状特性鉴定实验

bamboopiggy

1.RNase R消化检测 RNase R是一种来源于大肠杆菌的核酸外切酶，它可以沿RNA的3’-5’方向切割、降解RNA，能够消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化呈环形的RNA、套索结构或3’端突出末端少于7 nt的双链RNA分子。RNase R检测并非是必须的，但可以作为一个很典型的实验证明和鉴定circRNA。RNase R主要用于circRNA的鉴定和富集实验，需要根据具体的实验内容和

3 回答795 围观

问大家好，我的内参ct值为19,目的基因为13，请问我还能继续稀释模板嘛？

whilt-shirt

你这个情况可以再稀释2-4倍。

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问提取质粒，但是再次用通用引物电泳验证时，在最上方跑出一条条带，请问是为什么呢？

天一湖医者

做酶切了么？如果抽出来没有酶切因为质粒的不同构型，会看到不同的条带。如果抽完质粒再做一个单酶切，得到的就是线性的条带，就只有一条了。

3 回答305 围观

问如何用QPCR数据检测基因的表达丰度

whilt-shirt

先提取RNA，逆转录成cDNA，然后根据说明书加入qPCR试剂，上级，等机器检测完就能看到结果了

3 回答565 围观

问qPCR引物连续四个G或者自我互补分数太高可以用吗？

天一湖医者

可以用，但也不要太高，否则不利Taq 酶的催化反应。

3 回答866 围观

问提取烟草RNA一定要液氮吗？

dxywode

其实是提取烟草的RNA,看基因的表达量,因为比较老了,要加液氮来磨才能充分破碎。

4 回答458 围观

问求助荧光定量PCR的结果分析 RQ min和RQ max的算法？

天一湖医者

∆Ct SD =SQRT(Ct targetSD^2+Ct referenceSD^2

3 回答1230 围观

问做rtPCR有哪些特别重要的影响结果的关键因素？

whilt-shirt

DNA酶的影响，试剂，加样手法等都会影响结果

5 回答524 围观

问跑定量内参cq 值在30-31之间，复孔差值小于0.2，数据还能用吗？

whilt-shirt

一般内参的Cq值超过24就可以认为核酸降解了，这时候的数据是不能用的

5 回答526 围观

问跑荧光定量pcr 曲线有双峰,primer设计引物分数是满分，求大神给个建议。

balalaLy

如果是主峰前面出峰，一般是引物二聚体，如果是后面，可能是非特异扩增，可降低引物浓度，退火温度和镁离子浓度

6 回答468 围观

问RNA 提取260/230比值在1.7这样，能反转录做荧光定量吗？

balalaLy

有点偏低，估计是乙醇没有挥发掉，但还是可以做的。

6 回答2413 围观

问菌液PCR全假阳性,咋回事

cab2

可以先用cracking液裂解细菌，然后菌液跑胶看质粒大小

4 回答1180 围观

问关于随机引物反转录的一些问题

Eason老歌迷

你想纯化，但是发现没有过滤掉短的，是这样吗？我有一个方法，可以试一试。1. 20μLPCR产物加入5 μL 5M的NaCl（终浓度0.5 M）。2. 加入25 μL 24%的PEG8000溶液（终浓度12%）；混匀。3. 4度放置30 min。4. 4500 g，4℃离心30 min 后，立即将板反扣在厚的吸水纸上，离心至150 g，去除上清。5. 加入70 μL 75%EtOH，4500 g，4

3 回答529 围观

问酿酒酵母基因敲除菌液pcr没有条带

急诊科ys

1排除细菌污染可能2提取过程是否存在问题，必要时可重新提取进行实验

5 回答581 围观

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