为什么用双层平板法纯化过几次的噬菌体无法在单层平板上形成空斑？

宿主菌没有污染，使用的宿主菌为一次培养后分装每次使用。双层平板还是能做出来，但噬斑边缘没有第一次使用双层平板纯化时边缘整齐。使用双层平板扣斑到1mlSM缓冲液中，每次使用该过夜缓冲液100微升和300微升宿主菌孵育20min后倒入7ml上层琼脂做双层平板，过夜培养可得该缓冲液噬菌体浓度至少105，再使用该缓冲液5微升点滴至涂布了宿主菌的单层平板时，单层平板无噬斑出现。