哪位大神做过病毒蚀斑纯化吗？可以提供一个病毒蚀斑纯化详细的protocol吗？拜托了，先谢谢大家了！

流程

1. 铺板

将已长满80~90%RDcell消化均匀铺于6孔板中。

2. 病毒感染

细胞长成单层达80~90%吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度，并向每孔中加入200μL 稀释好的病毒液（阴性对照加DMEM200μL ），置于37℃温箱吸附两小时后弃残液。

3. 制备2%琼脂糖

使用低熔点琼脂糖配方：0.2g 加入10ml 无菌PBS 中，121℃高压灭菌15min ，取出后置于55℃水浴锅中待用。

4. 混合

将上述琼脂糖和2X 维持液(FBS浓度为2%）40~50℃水浴1:1混合后，加入培养板各孔，每孔2ml, 室温放置30min 以上使其冷却凝固成覆盖层。

5. 培养

把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养48h 。

6. 染色

制备含0.2%结晶紫(生理盐水稀释）的2%琼脂糖：双倍维持液（1：1），置于40~50℃水浴待用，吸取上述混合液加入培养板各孔，每孔2ml, 使冷却凝固成第二覆盖层。

7. 培养

把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养48h 观察，每皿蚀斑数量＜10个的稀释度中，挑选附近10mm 均为健康的蚀斑。

8. 将挑选的病毒至少再传2代。

1)制备单层vero细胞,加入含病毒的样品液,吸附1小时;2)将吸附后的细胞表面覆盖一层MEM固体培养基培养至病毒蚀斑出现;3)挑取病毒蚀斑获得病毒液.本发明的方法用病毒样品吸附Vero细胞单层,覆盖MEM细胞固体培养基,3-5天可以看到明显的蚀斑形成,实验证明,经过3轮蚀斑纯化和扩增后,RT-PCR检测和测序表明已经得到纯化的病毒株.

1. 准备相应的病毒宿主细胞，消化均匀后调节细胞浓度，以适宜的浓度接种于六孔板中；

2. 待细胞长成单层后吸弃培养液；

3. 准备病毒液，进行十倍梯度稀释，获得五个浓度的病毒液。分别向每孔滴加适量病毒液，37°C下吸附2小时吸弃病毒液；

4. 制备2% 的低熔点琼脂糖溶液，置40~50°C水浴中待用；

5. 将上述琼脂糖与2×细胞维持液按1：1的比例混匀后，加入各培养孔中，2 mL/孔，冷却后凝固成覆盖层；

6. 倒置培养板，置于37°C二氧化碳培养箱中培养；

7. 每天观察细胞病变情况，出现明显病变时进行二次覆盖。取上述方法混合的混合液，加入中性红使其浓度为0.002%，向各培养孔中加入2 mL混合液，使其冷却凝固形成第二覆盖层；

8. 倒置培养板，置于37°C二氧化碳培养箱中继续培养，48小时内观察结果；

9. 选取合适大小的蚀斑下作病毒的下一步增殖和鉴定。使用1 mL的蓝色枪头，提前剪掉尖端部位，使枪头口径与蚀斑大小相仿，然后用移液器直吸取蚀斑，覆盖物也一起被吸入枪头。