蛋白提取及纯化方法操作

蛋白提取纯化方法

1蛋白质（包括酶）的提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

（1）水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。

一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。

但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提取过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

（2）有机溶剂提取法

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。

丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

02蛋白质的分离纯化

根据蛋白质溶解度不同的分离方法

（1）蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。

盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

（2）等电点沉淀法

蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

蛋白纯化系统的实验步骤

1. 如果凝胶过滤的介质是干粉，则需在凝胶过滤缓冲液中完全溶胀。

2. 在远离过往通道及直接光照的恒温环境，将层折柱垂直安装在稳固的实验室支架上。

3. 用一注射器将凝胶过滤缓冲液从柱子的输出管注入柱子，至缓冲液达到柱子支持体平面之上，注射器留在输出端以堵住柱子。

4. 沿着一根顺柱子内壁而放的玻璃棒将凝胶混悬物倒入柱子至所设高度，再小心往凝胶顶部加入1 cm 高的一层缓冲液，并连接缓冲液贮存容器，取去堵着柱子输出管的注射器，用2~3倍柱床体积的缓冲液清洗柱子。

5. 流尽柱子凝胶顶部上面的缓冲液、关闭其输出管。

6. 加入相当于柱床体积1%~5%的蛋白质样品。开放输出管，让样品流进柱床，凝胶上面的柱子内壁以缓冲液冲洗。

7. 在凝胶顶上用吸管加入1 cm 高的缓冲液层，重新与缓冲液贮存容器连接，开始洗脱。

8. 分部收集流出液。每分部相当于1%总柱床体积，分别测每个分部的A280，并各取小份样品测生物活性，选出有活性的分部用SDS-PAGE检测所含蛋白质的数量和质量，合并含目标蛋白的分部。

9. 用2~3个柱床体积的凝胶过滤缓冲液洗柱，柱子保存在含0.02%叠氮钠的缓冲液中，柱于可无限次地使用。

准备材料和步骤：

1. DEAE Sepharose快流离子交换柱和Sephacryl S-200 HR色谱柱：根据实验需要选择适当的柱子，这些柱子可以在实验室或生物科学供应商处购买。注意柱子的尺寸和配套的缓冲液。

2. 缓冲液：根据你的实验需求，准备适当的缓冲液。根据文献描述，DEAE Sepharose快流离子交换柱使用的是pH 7.4的50mM Tris-HCl缓冲液。Sephacryl S-200 HR色谱柱使用的是50mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）。确保缓冲液的配制和pH调节正确。

3. 样品处理：根据你的实验目的和样品类型，准备透析后的样品。确保样品已经去除了与实验不相关的物质。

4. 柱子平衡和样品加载：将样品在低盐条件下平衡DEAE Sepharose柱，并将上清液加载到柱子中。使用缓冲液洗涤柱子，并洗脱未吸附的物质。

5. 盐梯度洗脱：根据你的实验设计，使用递增浓度的NaCl溶液洗脱目标蛋白质。这将使目标蛋白质以逐渐增加的盐浓度从柱子中洗脱。

6. 进一步分级：收集具有最高浓度的级分，然后通过Sephacryl S-200 HR色谱柱进行进一步分级。使用50mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）洗脱，并收集相应的级分。