T载体连接转化后挑选阳性菌落跑菌液PCR，然后送测序，测序结果与参考序列比，长度少了100bp左右，这是为啥呢？

考虑体系内存在降解，可能是在pcr过程中断裂

可能有以下几个原因：

PCR扩增效率不高：可能PCR反应中使用的引物不能很好地扩增目标序列，或者PCR反应条件不够优化，例如反应温度、反应时间、引物浓度等，都可能导致PCR扩增效率不高，从而造成缺失。

DNA序列质量不佳：在PCR扩增之前，DNA样本质量可能不够好，可能存在DNA降解或样本受到其他污染的影响，从而影响PCR扩增效果和测序结果。

转录本长度问题：如果您测序的是RNA，而不是DNA，那么长度少100bp左右的原因可能是因为目标转录本较短，或者转录本在不同组织或细胞类型中存在差异。

数据分析问题：最后一个可能是测序数据的分析问题。参考序列可能是来自于某个不同的基因组，也可能存在测序数据拼接的问题，从而导致比对结果的偏差和差异。

综上所述，需要检查PCR反应条件和DNA样本质量，排除可能的扩增偏差和样品污染，同时也要检查测序数据的分析方法，以确认缺失的原因。

1 引物不特异,可以提高退火温度试试；2 预测的目的片断偏大。