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        蛋白纯化问题,换了不同载体,不同感受态,都表达不出目的蛋白

        user-title

        goonQ2HM

        将实验室所有不同标签(包括his gst mbp)都连接我的目的基因,并且转了多种不同的感受态(BL21, DE3,还有带有稀有碱基,去除细胞毒性的感受态等),都不能表达出我的目的蛋白,这是什么原因呢?要做pull-down实验,除了酵母互作,BIFC,萤火虫荧光素互作实验外,如果蛋白一直提不出来,还能用什么方法做体外的互作呢,请各位大神提出宝贵意见!卡这很久了,太折磨了

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        4 个回答

        user-title

        Eason老歌迷

        有帮助

        感觉还是你的质粒没有构建好,你可以查查文献,看大家表达这个目的蛋白都用什么载体。

        user-title

        goonQ2HMuser-title

        都是测过序的,肯定没有问题的

        user-title

        冷泉港蛋白

        有帮助

        不表达有几个原因:

        1.基因中是否有终止子

        2.插入基因是否错位

        3.片段是否过长 100kd?表达不出来!可以考虑截短,表达结构域

        4.是否是膜蛋白或细胞毒性蛋白,UniProt数据库看下

        5.查下商业化的是否有这个蛋白,或者是不同物种的,做下参考

        6.查下文献

        7.最好能放个图

        user-title

        goonQ2HMuser-title

        感谢提了这么多宝贵建议,如果是膜蛋白,那就不能表达出来吗?

        user-title

        dxy_gwrp7ndq

        有帮助

        1.也许是蛋白表达过低,SDS-PAGE不能发现。2.可能是你用的菌错了

        user-title

        府宅

        有帮助

        1:质粒是否成功转化到你的宿主菌。2:改变诱导时机和诱导剂浓度,一般当OD值在0.5-0.6时较好。3:也许蛋白已经表达,只是不是已可溶形式表达的。

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