基因敲除结束后再进行回补，获得的回补菌株没有恢复到原先的水平怎么解释？

要特别注意做回补的时候，移码突变的必须要做cDNA突变，就是同义突变，将CRISPR识别的PAM序列去掉才行，要不然，回补的cDNA也会被切割破坏掉。注意移码突变的过程中，有一定概率出现的WB背景杂带的问题比较麻烦。回补之后的序列可能会干扰到回补片段的表达鉴定。