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科研学霸天团,48小时有问必答
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流式与werstern的区别?
丁香实验
(1)Western 是检测蛋白表达的金标准,可用于检测细胞多种类型的蛋白;流式细胞术的方法多用于检测细胞膜蛋白,虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内蛋白,但对于分泌蛋白却是无能为力的;(2)Western测蛋白含量对抗体的量需要很少,一般1:1000左右,而流式对抗体的需要量很大,一般1:50(很浪费抗体);(3)采用Western方法检测细胞蛋白含量的变化一般要有内参,
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问
流式中检测细胞表面和细胞内蛋白表达水平的抗体有何区别?
丁香实验
抗体只是针对相应抗原的,至于是针对胞内还是胞膜对你检测来说并无明显影响,你只需要查清楚到底是针对哪一个部位的抗原的,应该是可以用同一种抗体进行检测的,在流式操作时只需注意:如果是针对胞内,则需要加破膜剂,让抗体能和相应抗原接触,否则就不需要了。
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问
流式同型对照怎样选择?
丁香实验
同型对照:是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类,若使用直接免疫荧光染色法,同型对照也应标记荧光色素,如IgG1 FITC、IgG2a、PE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外,同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F:P比值(标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值)应该相同为最佳,这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义,切忌使用与
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问
构建的原核表达载体不表达我的目的蛋白是为什么?
cpu2004
做个mRNA,如果mRNA水平就有问题加融合伙伴,尝试在C端(优先)和N端加入融合伙伴,有时候是某些蛋白的mRNA在你的表达系统中不稳定
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问
同源性太高的基因,如何设计 TALEN 靶点?
jiayitu
这个确实很大一部分都被敲除了,还有一些别人没做出来的,我这个就是这个项目组的。。
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问
大肠埃希菌能使甘露醇,蔗糖,麦芽糖产酸产气吗?
云天昊
这个是应该是可以的
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问
慢病毒在成纤维细胞过表达IL-32,看其对细胞增殖凋亡的影响体外,买现成的人成纤维细胞,若不建立稳转的细胞,能说明实验的有效性吗
yyygo
慢病毒在成纤维细胞过表达IL-32,看其对细胞增殖凋亡的影响,不进行稳转细胞系构建,也能说明实验的有效性吧对细胞增殖凋亡的影响短时间的3-4天可否满足如果可以就不必进行了,那个时间太长了要持续半年耗不起
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问
大肠杆菌感受态细胞制备时的CaCl2浓度到底是多少呢?
我是金博士
我们用0.1 mol/L,参照分子克隆的来。用CaCl2·2H2O可以,只要浓度一样就行了。
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问
细胞免疫荧光用 4% 多聚甲醛固定,1% BSA 封闭,这两步可以不要吗?省去会有什么影响?
stellaff
“加荧光标记抗鼠抗体(第二抗体)工作液20ul,混匀振荡置4℃/30分钟(时间不能超过)。”请问这步必须是4℃/30分钟吗?时间不能超过,如果超过了会有什么影响?” 二抗不一定就是4℃ 30分钟,我们经常采用室温下避光孵育1小时,这样也可以得到较好的效果。细胞免疫荧光是需要固定的,根据目的蛋白的不同可以选择多聚甲醛或者丙酮,一般固定20分钟。封闭也是需要的 可以减少非特异性背景。
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问
感受态制备过程中,如何将第一次离心后的菌体悬浮?
hellokitty5
有一个诀窍就是离心的速度不能太高,如果用大型的离心机,转速在3 500-4 000 rpm 5-10分钟就可以了,只要你能把菌体离下就可以,不要太长时间,这样你的菌会很松,加上一些CaCl2轻轻弹几下就开了,再慢慢弹,慢慢摇, 包你很快做好。这是经验,试试吧。
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问
蛋白如何获取?
我是金博士
重组获得哦,通过基因克隆,表达获得蛋白。
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问
为何我提取组织 DNA 后,DNA 的纯度很低?
我是金博士
可以多管浓缩,最后过柱子的时候,把很多管的都集中到一管。
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问
显微镜目镜和物镜多少倍可以看见血小板?
论文菌
看不到的,confocal 60倍油镜 隐约能看到血小板
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问
求问刚出生胎鼠的膝关节部位软骨如何取材?
danieldan08
胎鼠太小了,不好取材,直接酶消化好了
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问
口腔材料的皮下植入实验,取材技巧?如何取出兔子体内的材料?
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问
链霉素的毒性反应及解救实验中可以用其他钙剂替换氯化钙吗?
我是金博士
没有特殊说明不要,同时看下氯化钙的作用。
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问
组织培养培养基
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问
灌胃时为何采用温水?
yuanwuping1987
体内环境温度会影响药物的ADME
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问
请大家推荐一款好用的转染试剂?
叶子的科研
N2a 也称为Neuro-2a,是小鼠来源神经瘤母细胞,对于外援物进入细胞体内很是敏感,我们实验室在转染siRNA到小鼠神经原代里面使用的是zeta life Advanced DNA RNA转染试剂,转后细胞状态基本没有变化,做wb和QPCR检测有敲低。
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问
使用脂质体瞬时转染,预实验是用空载体还是含有目的基因的载体做呢?还是两者都用
yyygo
脂质体细胞转染用目的载体做,预实验也相当于是摸索条件的了
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