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科研学霸天团，48小时有问必答

问如何设计质粒求求各位大佬帮忙

sswei

采用重组酶构建质粒方法1. 载体的制备一般推荐双酶切线性化，线性化完全，假阳性克隆低。酶切体系。2. 对于使用重组方式连接来说，PCR 要设计引物, 设计引物时要根据质粒载体和基因序列选择合适的同源序列，通过 PCR 扩增方式进行连接，PCR 的产物要纯化。引物设计原则简单总结一下：（1）前向引物：5’ 端--上游克隆载体末端同源序列+基因正向扩增引物--3’ 端（2）反向引物：3’ 端--基因反

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问酵母里的脂肪酸代谢反应

sswei

脂肪酸从头合成的场所是酵母细胞液中进行。

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问氨基酸的提取及检测步骤

sswei

氨基酸的提取（可根据预实验结果适当调整样本量及比例）①细菌或细胞：离心收集细菌或细胞至离心管内，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为（500-1000）：1的比例（建议500万个细菌或细胞加入1 mL提取液）处理样品，冰浴超声破碎细菌或细胞（功率20%或200 W，超声3 s，间隔10 s，重复30次），沸水浴提取15 min（密封以防止水分散失），冷却至室温后，4℃ 10000

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问中药红藤和败酱草治疗盆腔炎适合采用水提还是醇提？

loveliufudan

对于红藤和败酱草来说，主要的活性成分分别是氧化石蒜碱和败酱素。氧化石蒜碱是水溶性成分，更适合用水提取；败酱素是脂溶性成分，更适合用醇提取。但是具体到治疗盆腔炎，因为炎症反应主要是体内的免疫反应，不同的患者可能需要不同的药物成分来调控。因此，到底应该使用水提还是醇提，这可能需要考虑到患者的具体情况

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问siRNA敲降刺激后才升高的基因，什么时候加这个刺激，在转染siRNA同时，还是转染24到48h后。

loveliufudan

siRNA转染后通常需要一段时间（通常24-48小时）才能充分地敲降目标基因。因此，如果你想要在敲降后观察基因刺激的效果，你可能需要在转染siRNA一段时间后再添加刺激物。另一方面，如果你同时加入刺激物和siRNA，有可能在siRNA完全发挥作用之前，基因已经被刺激上升。这样可能会使得观察到的效果不准确。因此，通常建议的做法是先转染siRNA，等待24到48小时让siRNA发挥充分的敲降效果，然后

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问过氧化氢诱导建模应该怎么选购呢？

loveliufudan

一般来说，购买过氧化氢应该通过专业的实验室试剂供应商或化学品供应商进行购买，这些供应商提供的过氧化氢通常符合实验室安全标准，但是去药店买“双氧水”也是可行的。

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问小鼠鼠源性胰腺癌细胞皮下瘤，放疗增敏给多少剂量合适

feixue7758527w

放疗增敏剂一般都是按体重计算的，有的是5mg/kg，有的是870mg/kg，具体要看你用什么放疗增敏的。

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问pH 4.5的乙酸怎么配制？

sswei

如果用冰醋酸与氢氧化钠配制。PH=PKa-lg[HAc]/[Ac-]4.5=4.75-lg[HAc]/[Ac-]lg[HAc]/[Ac-]=4.75-4.5=0.25[HAc]/[Ac-]=1.78/1需要冰醋酸的质量为0.1×1.78/2.78×60=3.8克需要氢氧化钠的质量为0.1×1/2.78×40=1.4克将两者与水配制成一升溶液即可。

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问求助，BAF3悬浮细胞系进行质粒转染用啥转染试剂成功率高啊。

烧伤科常医生

我的经验是使用磷脂体转染试剂成功率能高一些

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问测定海参中的钒含量采用哪种方法比较好

土井挞克树

石墨炉原子吸收的方法比较精确，ICP-MS相对精准性差一些

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问求助🆘测定某种细菌对动物的半数致死量，应该怎么分组，怎么设置浓度梯度，每组的实验动物最少得多少只？

dxyc42u

分组就设置为正常对照和感染组，浓度可以参考文献中的，每组有四五只动物就行

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问咨询一下广大的网友，我接下来需要在秀丽隐杆线虫体内过表达自身的miRNA，如何选择载体？

dxyc42u

选择构建过表达质粒就可以了。。

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问蛋白质纯化洗脱中洗脱液的梯度如何操作

loveliufudan

“从0到400mM的递增NaCl溶液”的意思是用NaCl浓度从0mM开始，逐步增加至400mM的一系列NaCl溶液进行洗脱。这个操作通常是为了逐步改变柱子环境的离子强度，从而分级洗脱在离子交换柱上不同程度吸附的蛋白质。通常的方法是，首先准备一些NaCl溶液，如0mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM等。这些溶液可以根据实际需要和实验要求准备。然后，你可以首先使用0mM的Na

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问请问透射电镜观察细胞线粒体，自噬小体前的收样准备工作时，可以用胰酶消化法收集细胞样本吗？胰酶会破坏细胞超微结构吗？

loveliufudan

为了尽量保护细胞的超微结构，在进行透射电镜样本的制备时，一般推荐采用更为温和的细胞分离方法，比如机械搅拌或使用酶混合物如胰酶和EDTA的低浓度溶液。并且要尽量缩短酶的作用时间，避免对细胞的超微结构产生破坏。总的来说，可以用胰酶进行细胞分离，但是需要严格控制胰酶的作用条件，以保护细胞内部的超微结构。同时，在收集细胞样本后，需要迅速进行固定和包埋等后续步骤，以防止细胞结构的进一步破坏。

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问求完整的DASH饮食评分表，以及计分原则？

loveliufudan

关于DASH饮食的评分表，不同的研究中可能会有所差异，因为评分可能会根据研究的特定目标或人群进行调整。但基本的原理是根据个体的食品类别和摄入量进行评分，与DASH饮食指南的建议相符者得分更高。下面是一个基本的DASH饮食评分示例（每日摄入）： 1. 全谷类：每日6-8份，每份对应1分。 2. 蔬菜：每日4-5份，每份对应1分。 3. 水果：每日4-5份，每份对应1分。 4. 低脂奶制品：每日2-3

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问DEAE Sepharose fast 离子交换柱上样前是否需要过0.45μm的膜

loveliufudan

DEAE Sepharose Fast Flow是一种阳离子交换色谱介质，常用于蛋白质纯化。其颗粒大小通常在90-165微米范围内，因此理论上，对样品进行0.45微米或0.22微米的过滤并不会影响到色谱柱的填充物。过滤样品的目的主要是为了去除可能阻塞柱的大颗粒物质，比如细胞碎片或未溶解的沉淀物。如果你的样品已经通过其他方法（例如离心或超速离心）去除了这些大颗粒物质，那么可能不需要再进行过滤。但是，

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问蛋白质分离纯化过程中各种缓冲液如何配制

loveliufudan

这些缓冲液的配制主要涉及到以下化学物质：Tris，盐酸，NaCl，EDTA，NaH2PO4，PMSF和protease inhibitor cocktail。下面是每种缓冲液的具体配制方法： 1. 匀浆缓冲液：先在适当体积的去离子水中溶解适量的Tris和NaCl，再加入EDTA。之后使用盐酸或者氢氧化钠调整pH到8.0。所有物质应配成最终浓度为200 mM Tris-HCl，150 mM NaCl

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问GC-MS前处理怎么判断是否需要衍生

loveliufudan

判断样品是否需要衍生化的关键因素包括： 1. 样品的挥发性：如果样品中的化合物不能在GC的工作条件下挥发，则需要进行衍生化。这通常涉及到极性、热稳定性和分子大小的问题。 2. 样品的化学稳定性：如果样品中的化合物在GC的工作条件下会分解或反应，则可能需要进行衍生化以提高其稳定性。 3. 需要提高化合物的检测灵敏度或选择性：通过衍生化，可以改变化合物的化学性质，提高其在GC-MS中的检测灵敏度或选择

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问Protocol 里面写的PBS清洗细胞的时候，是每次都需要重新离心细胞并吹匀吗？

loveliufudan

在很多情况下，使用PBS洗涤后，会通过吸取去除PBS，而不需要再进行离心。然后加入新的缓冲液或试剂直接进行下一步的实验操作。这样操作的原因是，频繁的离心可能会对细胞造成压力，甚至可能导致细胞损伤。但在某些情况下，例如在需要完全清洗掉PBS，或者需要收集细胞进行下一步实验时，你可能需要在PBS洗涤后进行离心，并用吹管吹匀悬浮细胞。

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问检测细胞的GFP绿色荧光表达，样品需要计数吗？

烧伤科常医生

可以取一部分细胞进行流式，细胞密度不同会有影响

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