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抗体孵育——WB真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。无论你如何提高自己的转膜技术，高效和低效之间往往只有数倍的差异，而抗体的效价可以差数千倍以上；同样，正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差异的最大化。封闭最短可以缩减到5min：很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB（说实话，经常看到坛子上很多人这样给人答疑，非常的无语）；实际上封闭（极端点）也是个可有可无的步骤，真正对降低背景起核心作用的是抗体稀释液中的组分。当你的抗体使用次数较多时，基本不用封闭也可以有较低的背景；如果抗体很新，其实封闭最短可以缩减到5min（没试过更短的，不一定不可以）。那什么导致高背景甚至黑板呢？抗体的质量不太好（主因），或者抗体稀释液的配方有问题（增大抗体稀释比略微有所改善）。封闭液的配方可以和抗体稀释液相同，也可以不同；通常封闭液是最简单（单方）的抗体稀释液，而抗体稀释液可能是复方。封闭很少出状况。不过在milk做封闭剂的封闭液中，milk颗粒未完全溶解时，微小的颗

条件性基因敲除的基本原理 Cre ／ loxP 重组系统条件性基因 敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。1．Cre／loxP系统的原理Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X―over in P1)。②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位

LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的 lysogeny broth，即溶菌肉汤。

1. A液（0.2M磷酸二氢钠水溶液）： NaH2 PO4 ・H2 O 27.6g，溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。2. B液（0.2M磷酸氢二钠水溶液）：Na2 HPO4 ・7H2 O 53.6g (或Na2 HPO4 ・12 H2 O 71.6g或Na2 HPO4 ・2 H2 O 35.6g ) 加蒸馏水溶解，加水至1000ml。3. 不同pH值磷酸盐缓冲液（PB）缓冲液的配制A液X ml (参照下表) 中，加入B液Y ml，为0.2M PB。若再加蒸馏水至200ml则成0.1M PB。PHX mlY mlpHX mlY ml5.793.56.56.945.055.05.892.08.07.039.061.05.990.010.07.133.067.06.087.712.37.228.072.06.185.015.07.323.077.06.281.518.57.419.081.06.377.522.57.516.084.06.473.526.57.613.087.06.568.531.57.710.090.06.662.537.57.88.591.56.756.543.57.9

慢性炎症与自身免疫性疾病、过敏性疾病和肿瘤的发展密切相关，炎性因子白介素 - 17（IL-17）家族在促进宿主防御和自身免疫性疾病中起着重要作用。IL-17 家族由六个成员组成（包括 IL-17A、B、C、D、E、F），IL-17D 是 IL-17 家族中了解最少的成员，其受体也尚不明确。 图片来源：Frontiers in Immunology(1)2021 年 4 月 13 日，清华大学医学院董晨院士团队在 Immunity 上在线发表了题为 Interleukin-17D regulates group 3 innate lymphoid cell function through its receptor CD93 的研究成果 (2)。 该研究发现肠上皮细胞来源的 IL-17D 通过与其受体 CD93 结合，在调节三型固有淋巴样细胞（ILC3s）功能并维持肠道稳态中发挥关键作用。 图片来源：Immunity研究内容「我是谁」IL-17D 有什么生理功能？为了了解 IL-17D 的生理功能，作者首先检测了 IL-17D 在小鼠组织中的表达情况，结果发现 IL17D 在小鼠的结肠和

自山中伸弥获得 2012 年诺贝尔医学奖以来，人们对干细胞在再生医学中的应用寄予厚望。可 9 年过去了，iPSC 的出现依旧未能解决干细胞研究领域最大的问题：如何获得大量的人类全能干细胞？ 胚胎干细胞，作为另外一种全能干细胞的来源，由于伦理学原因同样进展缓慢。但为了规避这个问题，一些科学家「另辟蹊径」打起来了跨物种嵌合体的主意。 图片来源：Cell 2021 年 4 月 16 号，来自我国昆明理工大学的季维智院士、谭韬教授、牛昱宇教授携手索尔克生物研究所的 Juan Carlos Izpisua Belmonte，在 Cell 上刊登了题为 Chimeric contribution of human extended pluripotent stem cells to monkey embryos ex vivo 的研究 [1]， 报道了人类首次在体外制造出了人猴嵌合胚胎，为体外大量制备人类多能干细胞提供了新的可能。 研究内容： 得益于昆明理工大学季维智院士团队所开发出的，能够使得猕猴胚胎在体外「超长待机」的新技术，Juan Carlos 教授团队与北京大学邓宏魁教授团队此前得到的人

春暖花开，波光粼粼。实验之余，靠着绿树阅读文献、了解最新研究进展也是一件惬意的事。本周学术君继续带你遨游科研之海吧！1. Nature: 解密太平洋地区的人类血统 太平洋地区包括近大洋洲和远大洋洲，人类约在 4.5 万年前在近大洋洲定居。 2021 年 4 月 14 日，法国巴斯德研究所 Lluis Quintana-Murci 教授团队在 Nature 杂志上发表研究论文 Genomic insights into population history and biological adaptation in Oceania。 该研究详细地分析了太平洋地区的人群历史，阐释了人类演化、古人类种群间的基因交流和古人类对岛屿环境的适应性。 该工作揭开了太平洋地区人类血统的神秘面纱，对于人类厘清自身规律具有重要的指导意义！ 图 1：来源 Nature 2. Nature Metabolism: 为什么有的人总是容易饿、吃得多 目前，肥胖影响着全世界 38% 的成年人、16% 的儿童和青少年的健康。 2021 年 4 月 12 日，在 Nature Metabolism 杂志上发表研究论文 P

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，受到细胞内外信号交互作用的精密调控。D 型细胞周期蛋白 (cyclin D1, D2 和 D3) 与细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）是整个细胞周期调控机制中的核心分子，驱动细胞增殖。细胞周期失调是人类癌症的一个共同特征，其中 cyclin D-CDK4/6 复合物的水平和活性与不受约束的细胞增殖密切相关。自从 20 世纪 90 年代发现 cyclin D 以来，人们就对其进行了深入研究，但是关于 cyclin D 的降解机制和调控机制尚不完全清楚。 2021 年 4 月 15 日，Nature 三连发表重磅论文为长期探索的科研难题，D 型细胞周期蛋白如何正常降解，提供了答案。同时 Nature 还在线发表题为 Path to destruction for a cell-division regulator 的 News & Views，高度评价了三个团队从不同的角度切入，完善了周期蛋白调控和降解机制，提高了我们对整个细胞周期进程的理解。图片来源：Nature Simoneschi，Chaik

背景介绍多项研究结果均表明，睡眠不足与心血管 (CV) 疾病和全因死亡相关，这也是普通大众对睡眠的基本认知。此外，睡眠时间与全因死亡率和 CV 死亡率之间呈 U 型关联，过短 (<6 小时 / 天) 和过长 (>8 小时 / 天) 都是不利于健康的，可见并不是睡得越多越好。事实上，睡眠长度本身并不能反映关键的神经生理学方面，睡得长并不代表睡眠质量高，也不代表有着良好的睡眠连续性和睡眠深度。前期的研究结果也显示，睡眠不规律、入睡困难等均与死亡风险增加有关，而与睡眠时间长短无关。先前的研究尽管表明了睡眠时间过短或过长都与死于心血管疾病或其他原因的风险增加有关。然而，直到现在，人们还不知道在夜间睡眠中唤醒负担 (唤醒次数和持续时间的组合) 是否也与死亡风险有关，唤醒负担 (AB) 在心血管相关疾病和全因死亡率的详细临床意义仍然未知。 2021 年 4 月 20 日，来自澳大利亚阿德莱德大学电气和电子工程学院等单位的研究团队在 European Heart Journal (IF = 22.67) 在线发表了题为 Sleep arousal burden is associated

人体所需的 9 种必需氨基酸中，有 3 种被称为支链氨基酸 （BCAA，Branched Chain Amino Acid）： 亮氨酸（Leucine）、异亮氨酸（Isoleucine）、缬氨酸（Valine）。BCAA 也是健身补剂市场上历史最悠久、据说最有效的产品之一。随着「健康」的重要性被越来越多的人认识，大量健康的饮食方式层出不穷。「地中海饮食」、「生酮饮食」、「低碳水饮食」等各种饮食方式也进入了大众的视线。不少饮食方式也推荐大家摄入更多的蛋白质，来取代碳水与脂肪。然而，这些做法真的是百利而无一害吗？学术界其实并未给出明确的答案。图片来源：Cell Metabolism 2021 年 4 月 22 号，Cell 子刊 Cell Metabolism 在线刊登了由威斯康星大学的喻德阳博士作为第一作者，其导师 Dudley W. Lamming 担任通讯作者的论文 [1]，题为 The adverse metabolic effects of branched-chain amino acids are mediated by isoleucine and valine。该研究发现

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）在多种生物过程的调节中至关重要，是 NAD + 代谢相关酶的底物。在啮齿类动物中，肝脏、脂肪组织和骨骼肌中不充分的 NAD + 生物合成会导致肥胖和衰老相关代谢异常的疾病，包括胰岛素耐受性、β 细胞功能障碍和肝脏脂肪变性。NAD + 生物合成的主要途径包括烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN），随后 NMN 转化为 NAD+。NMN 的产生是哺乳动物 NAD + 生物合成的关键限速因子。 已有研究发现高脂饲料喂养的肥胖小鼠全身注射 NMN 可增加组织 NAD + 浓度，改善葡萄糖耐量、胰岛素敏感性和 β 细胞功能。正常饲料喂养的小鼠长期注射 NMN 可缓解衰老相关的胰岛素耐受。NMN 补充剂对啮齿动物的有益影响导致了其在人体健康领域应用的快速发展，NMN 作为一种改善血糖控制、增强能量代谢和逆转衰老代谢并发症的补充剂，已经在欧美多个国家销售。 尽管许多天然食物中有 NMN 的存在，包括毛豆，花椰菜，牛油果，西红柿和牛奶，但是健康饮食中 NMN 日总含量仍不足 2 mg / 天。商业产品中每粒胶囊 NM

春暖花开，鸟语花香。今天虽然是工作日，却也是五一小长假来临的号角。实验之余了解下 CNS 的最新研究进展，不失为缓解科研压力的一种方法。 1. Cell Host & Microbe：全面分析婴儿肠道微生物中抗生素抗性基因 婴儿的免疫系统脆弱且敏感，其肠道中生长的微生物非常容易受到外界干扰，从而影响婴儿的身体健康。 2021 年 4 月 21 日，丹麦哥本哈根大学 Soren Johannes Sorensen 团队与哥本哈根儿童哮喘病协会 (COPSAC) 联合在 Cell Host & Microbe 杂志发表了论文 The infant gut resistome is shaped by environmental exposures and associates with gut bacterial maturity, and asthma-associated bacterial composition。该研究利用宏基因组测序技术，对来自丹麦 COPSAC2010 出生队列的 662 名 1 岁 婴儿肠道微生物组中抗生素抗性基因进行了全面分析，检测到 4

阿兹海默症（AD），是世界上患病人数最多的神经退行性疾病。折磨着近五千万中老年人，并给他们的家庭带来了沉重的负担。日益严峻的老龄化危机，使得确诊 AD 的人数正以一千万每年的速度飙升。令人遗憾的是，尽管科研院校与医药企业每年都投入大量的资金来寻找治疗与预防 AD 的方法，但几十年来，人类在对抗 AD 的战争中屡战屡败，至今并未找到任何能够有效治疗 AD 的药物。 导致 AD 无药可用的一个重要原因就是，血脑屏障的存在使得大分子药物难以触及疾病发生的位置，能够跨过血脑屏障的小分子药物因此开始受到医学界的重视。 图片来源：Brain 2021 年 4 月 14 号，来自日本东京大学的 Taisuke Tomita 教授与 Motomu Kanai 教授联合带领团队，在大脑研究领域著名期刊 Brain 发表了题为 Photo-oxygenation by a biocompatible catalyst reduces amyloid-b levels in Alzheimer’s disease mice 的研究 [1]，报道了他们使用光氧疗法治疗 AD 的尝试，为 AD 的治疗提供了全新

2021 年 4 月 26 日，来自加利福尼亚大学、浙江大学药学院等单位的研究团队在 Nature Biomedical Engineering 在线发表了题为 Inhibition of post-surgery tumour recurrence via a hydrogel releasing CAR-T cells and anti-PDL1-conjugated platelets 的文章， 该研究报道了一种生物可降解的水凝胶储层，而且这种水凝胶可以创造一个有利的环境，可以在手术后清除残留的肿瘤细胞并防止肿瘤复发。北卡 Gianpietro Dotti 教授与浙大顾臻教授是文章共同通讯作者。图片来源：Nature Biomedical Engineering背景介绍 当前，尽管有手术、放疗和化疗等多种治疗肿瘤的方式，但切除实体肿瘤的患者经常出现复发，同时术后炎症也可以触发肿瘤的生长和转移。近年来，免疫疗法通过阻断免疫检查点来激活肿瘤部位的 T 细胞，以此防止术后肿瘤复发。然而，只有在不到 20% 的免疫原性肿瘤患者中对免疫检查点抑制剂有持续的临床反应；此外，免疫检查点阻断在那

目前有研究发现，肿瘤细胞可以通过组蛋白修饰、DNA 甲基化和染色质结构改变等协同作用，通过表观调控实现免疫逃逸。前期研究发现动态可逆的 RNA m6A 甲基化与肿瘤发生和转移之间存在密切联系。考虑到 m6A 甲基化的可逆性，研究团队推测肿瘤会通过调控 m6A 甲基化过程来改变肿瘤微环境。然而，肿瘤自身的（Tumor intrinsic） RNA 表观转录组是否参与免疫逃逸仍是未知的。 2021 年 4 月 27 日，清华大学徐萌团队联合中科院北京基因组研究所韩大力团队，中科院上海药物研究所杨财广团队共同在 Cell 子刊 Cell Metabolism 发表题为 Tumors exploit FTO-mediated regulation of glycolytic metabolism to evade immune surveillance 的研究论文。 图片来源：Cell Metabolism 研究内容 肿瘤细胞的 FTO 缺失通过增强浸润 T 细胞来抑制肿瘤生长 研究人员首先分析了 TCGA 数据库的黑色素瘤（SKCM）数据，利用五个基因（CD8A, CD8B, GZMA, G

2018 年 the Lancet 研究统计显示，空腹高血糖是中国人群寿命的第三大危险因素 (1)。人体 90% 的内源性葡萄糖来自肝葡萄糖生成（hepatic glucose production, HGP），是维持体内糖稳态的重要组成部分 (2)。 图片来源：the Lancet 空腹 HGP 增加是 T2D （2 型糖尿病）的标志，HGP 率高于正常生理水平，表现为肝胰岛素抵抗，葡萄糖代谢能力下降，是患者空腹高血糖的一个重要原因。现有的降糖药物对 T2D 患者有疗效，但仍有局限性。令人头疼的 HGP 失衡，显著加速了 T2D 的发病和发展，控制 HGP 对维持全身葡萄糖稳态至关重要！ 2021 年 5 月 5 日，武汉大学姬燕晓、折志刚、胡宇峰、李红良等团队合作在 Cell Metabolism 杂志上在线发表了题为 A kinome screen reveals that Nemo-like kinase is a key suppressor of hepatic gluconeogenesis 的研究成果 (3)。发现 Nemo 样激酶（NLK）作为一种新型肝糖异生负调控因

背景介绍 嵌合抗原受体 T 细胞免疫疗法，即 CAR-T，通过靶向谱系特异性表面标记分子在某些血液系统恶性肿瘤中显示了无与伦比的临床疗效。然而，由于缺乏高特异的抗原靶点和肿瘤浸润和活性差，CAR-T 细胞免疫疗法在实体肿瘤上大多是无效的。 目前，多数被 CAR-T 细胞靶向的实体肿瘤抗原是与肿瘤相关的，而不是肿瘤特异性的，这也就意味着它们不单单在肿瘤上高表达，其在正常组织中也存在低表达，这可能是导致严重的副作用的根源。因此，在细胞治疗中，发现新的肿瘤特异性抗原或其他肿瘤相关抗原配对的抗原组合能够更特异地识别肿瘤是特别具有意义的。除了增强肿瘤识别能力，CAR-T 细胞的表型特征和状态也可以极大地影响它们的治疗效力。与终末效应类 CAR-T 细胞相比，具有更长记忆表型的 CAR-T 细胞表现出更显著的抗肿瘤疗效，这也强调了 CAR-T 细胞持续活性对临床治疗的重要性。Tonic signaling 是 CAR 的特定结构，可以促进在抗原结合前受体聚集，因此有科学家提出：暂时中止 CAR 信号或减少 Tonic signaling 能够增强抗肿瘤活性。2021 年 4 月 29 日，来自加利

夏日好时光，本周学术君继续带你遨游学术之海，探寻科学的奥秘。 1. Nature Biomedical Engineering：首创冷冻微针治疗技术 细胞治疗，是一种能够将活细胞传递至体内发挥治疗效果的新型技术。 2021 年 5 月 3 日，香港城市大学徐臣杰教授研究团队在 Nature Biomedical Engineering 杂志上发表研究论文 Cryomicroneedles for Transdermal Cell Delivery。该工作首次创建能够负载活细胞的冷冻微针技术，该冷冻微针现成可用，避免了提前配制细胞注射液的繁琐步骤，有效地降低了细胞污染的风险。 该研究成果开启了微针应用于细胞治疗领域的全新时代，提供了一种微创、安全、简洁、高效的治疗策略，期待其早日应用临床！ 图 1: 来源 Nature Biomedical Engineering 2. Nature: 揭示重要的人科进化史 黑猩猩和倭黑猩猩是与人类最接近的灵长类动物，对其进行研究有利于了解人类进化。 2021 年 5 月 5 日，华盛顿大学医学院 Evan E. Eichler 教授团队在 Nature

胆固醇和脂质合成速率上调被认为是癌症转化过程中的一种特殊代谢重组现象。胆固醇是细胞膜的重要生物成分，是胆汁酸和类固醇激素生物合成的前体。此外，胆固醇相关代谢产物作为信号分子发挥调节作用。虽然有关胆固醇与结直肠癌（CRC）风险的流行病学证据仍然没有定论，但实验模型的结果表明两者之间存在因果关系。 甲羟戊酸途径与肿瘤进展相关，其中的关键酶受甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）家族转录因子的控制。然而，甲羟戊酸通路抑制剂（他汀类药物）只在部分患者体内发挥效用。因此，开发患者分层的生物标志物将有助于他汀类药物在抗癌治疗中的应用。 2021 年 4 月 30 日，来自中科院上海营养所和复旦大学的研究团队在 Molecular Cell 在线发表了题为 The ZMYND8-regulated mevalonate pathway endows YAP-high intestinal cancer with metabolic vulnerability 的文章。该研究报道了一种结直肠癌患者分型的新型生物标志物 —YAP。这种生物标志物依赖于 ZMYND8 调节的甲羟戊酸通路。因此，他汀类药物可能对

肥胖，又一「社会公敌」，是能量摄入和能量消耗不平衡的结果，也是糖尿病、心血管疾病等许多代谢性疾病发生和发展的危险因素。同时，肥胖也是一种慢性疾病，是目前全球公共卫生领域内非常棘手的挑战。导致肥胖的因素有很多，其中管不住嘴、迈不动腿可谓是最直接最重要的原因了 。近日，下面这项研究可能是很多「吃货」的福音了！2021 年 4 月 15 日，四川大学华西医院国家老年疾病临床医学研究中心何金汗领衔的团队在 JEM 在线发表了题为 Feeding-induced hepatokine, Manf, ameliorates diet-induced obesity by promoting adipose browning via p38 MAPK pathway 的研究性文章，这项研究结合体内外实验，揭示了 进食诱导的肝脏因子 Manf 在调节脂肪组织生热方面的关键作用，能减轻饮食导致的肥胖，为控制肥胖和相关代谢疾病提供了潜在的治疗靶点。图片来源：JEM主要研究内容Manf 是一种随进食诱导而上调的肝因子 肝脏在能量代谢中起着重要作用。进食过程中可以诱导肝脏释放激素 (称为肝因子)，作用于其他组