一、概述\ 气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物,而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质,如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。所以,HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱。 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实,有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。 ...
我们做蛋白质电泳的人都知道,银染色很灵敏,有很强的说服力,但通常胶背景较深,不易扫描。在这里介绍一下低背景的蛋白质银染方法。 Step Reagent Time/min Fix 50%EtOH 12%HAC 0.1%HCHO 38%H2O 60 Rinse 50% EtOH 5 min 3 times Sensitive 0.02% Na2S2O3 1 min Rinse Double disti ...
Invitrogen提供了大量的涵盖面广的蛋白分离预制胶,包括不同的成分,百分比浓度和格式。使用合适的胶百分比浓度,缓冲系统,上样孔格式以及胶的厚度,对于获得最好的结果非常重要。以下提供了帮助你选择适合你应用的正确凝胶的信息。 E-PAGE™ 96 High-Throughput System是整合的、无缓冲液系统,设计用来检测和分析大量的蛋白样品,时间仅仅需要14分钟。 NuPA ...
总 RNA 的电泳检测,原来我使用 Lambda DNA/EcoR I (或者 Hind III)酶切 Marker,现在基本上不再用 Marker 了。指示剂一定是溴酚蓝加二甲苯氰,胶浓度 1-1.2%。加样后,开始电泳 (电压的选择的唯一依据是,我后面的时间安排。)。 溴酚蓝出孔 2-3cm 后终止电泳,紫外观察。首先能吸引我的一定是非常亮的位置(是否上样过量),然后观察溴酚蓝到二甲苯氰之间的 ...
凝胶干燥时遇到的主要问题是凝胶的变形和破裂。将凝胶放在Whatman 3MM滤纸上可防止干燥凝胶变形,但凝胶是否破裂取决于凝胶的厚度和干燥器的质量,因此,应尽量使用薄胶并使凝胶干燥器处于良好状态,使其真空压力波动极少。 (1)试剂与配制:固定液:冰醋酸:甲醇:水(10:20:70) (2)电泳后的凝胶用5~10倍体积固定液在室温下固定,酸性固定液扩散后可使凝胶中的溴酚蓝变黄。蓝色全部消 ...
电泳是在溶剂中通过电场转移带电分子,任何带电的离子或者基团放置在电场中都将会迁移。除非在它们的等电点,大多数生物聚合物在任何pH值时都带有净电荷,它们将会以与电荷密度成比例的方式移动。分子在电场中的迁移取决于电场的强度、净电荷、分子的大小和形状、离子强度、粘度和分子移动介质的温度。作为一种分析工具,电泳简单、快速,并且具有高灵敏度。用来研究单一、带电荷的分子的特性,也用来作为一种分离技术。 支持 ...
在凝胶色谱技术应用之前,许多经典方法都可以测定高聚物的相对分子质量,如端基测定法、渗透压法、粘度法等,但在测定时都有局限。在相对分子质量分布(多分散性指数)成为人们关注的热点后,经典方法却不能同时测定聚合物的相对分子质量分布。凝胶(渗透)色谱(GPC)的应用改善了测试条件,并提供了可以同时测定聚合物的相对分子质量及其分布的方法,使其成为测定高分子相对分子质量及其分布最常用、快速和有效的技术。而GP ...
1. Introduction SDS-PAGE (Section 2.2) is probably the most commonly used gel electrophoretic system for analyzing proteins. However it should be stressed that this method separates denatured protein. ...
电泳法 电泳法是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,于电场的作用下,向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动,使组分分离成狭窄的区带,用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(%)的方法。 各电泳法,除另有规定外,照下述方法操作。 第一法 纸电泳法 1.仪器装置 包括电泳室及直流电源两部分。 常用的水平式电泳室装置如图,包括 ...
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一、试验目的 了解并掌握垂直板凝胶电泳的使用方法。 二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳是以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的一种区带电泳,由于此种凝胶具有分子筛的性质,所以本法对样品的分离作用,不仅决定于样品中各组分所带净电荷的多少,也与分子的大小有关。其次,聚丙烯酰胺凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应,即在电泳开始阶段,由于不连续pH 梯度的作用,将样品压缩成一条狭窄区带,从而提高了分离效果。 聚丙烯酰胺 ...
一、目的 蛋白质分子有单链、双链和寡聚蛋白等组成形式,组成蛋白质分子的单条肽链又称亚基。通过对天然蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳和变性蛋白的SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱的比较,可以研究种子蛋白质分子组成和结构。另外,SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳是测定亚基分子质量的好方法。通过本实验,学习SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、技术和实际应用。 二、原理 用十二烷基硫酸钠(SDS)和还原剂(琉基乙醇或二硫 ...
凝胶色谱属于液相色谱,它是按被分析混合物不同组分分子大小的不同进行分离的,多用于高聚物的分析。它以液体做流动相,以多孔固体做固定相,其中孔是有一定尺寸限制的,而且大小不一。它的分离过程是在装有多孔固定相的色谱柱中进行的。当尺寸大小不同的分子通过色谱柱时,可占据的体积也不同。对流动相分子而言,填料孔的尺寸大得多,因些,流动相可以自由扩散出入;而大小不同的样品分子则要渗透到不同的孔中,较大的分子只能进 ...
一、目的 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离带电颗粒原理;观察核苷酸类物质的紫外吸收现象。 二、原理 带电粒子在电场中向着与其自身带相反电荷的电极移动的现象,称为电泳。控制电泳条件(如pH 等),使混合试样中的不同组分带有不同的净电荷,各组分在电场中移动的速度或方向各不相同,从而达到分离各组分的目的,这就是电泳分析法。以醋酸纤维素薄膜作支持物进行电泳分析的方法称为醋酸纤维素薄膜电泳法。 在pH4.8 电 ...
原理: 以多孔性物质作固定相,样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。样品分子与固定相之间不存在相互作用力(吸附、分配和离子交换等),因而凝胶色谱又常被称作体积排斥色谱、空间排阻色谱、分子筛色谱等。比固定相孔径大的溶质分子不能进入孔内,迅速流出色谱柱,不能被分离。比固定相孔径小的分子才能进入孔内而产生保留,溶质分子体积越小,进入固定相孔内的机率越大,于是在固定相中停留(保留 ...
问:我的一些菌株产蛋白酶,但是想具体分析就必须要高量纯化,这是个问题?如何提高产量?还有有人问我,既然每个菌株都会产生一系列的蛋白酶,那么什么样的才是可以达到商业利用价值的,难道随便一株菌只要分离纯化出蛋白酶就ok了吗?(比较simple的idea)谢谢各位! 答:有多种因素影响菌株蛋白酶的产量,包括: 1、不同碳源对产酶的影响以及不同氮源对产酶的影响 2、碳氮比对菌株的生长和产酶有直接关系:例 ...
问:要抑制蛋白酶对细胞外基质的酶解作用,我想请教一下,在PH7-8之间蛋白酶的活性能够被明显的抑制嘛?因为PMSF毒性太大,还有没有别的抑制蛋白酶活性的试剂阿?EDTA能够抑制金属蛋白酶嘛?是不是跟EDTA螯合了Mg,Ca有关? 答:许多细胞蛋白酶只有在溶酶体的偏酸性环境中才具有最大的活性,将pH调制中性将有助于使蛋白酶的活性降至最低,但是仍然不能完全消除它的影响,目前最常用的方法是通过加入蛋白酶 ...
问:我现在正在做神经细胞的培养,听说木瓜蛋白酶的消化作用比较好,购买后发现,不是简单的用三蒸水配制,有哪位高手能告之一二,万分感谢! 答:我也用的sigma的木瓜酶,用hepes缓冲液很好溶的,一直没发现溶解度低的问题。 其实关于酶的选择,也不能简单的看消化作用如何,还要考虑到实验设计,比如说胰酶的消化效果总体尚可,特点是消化出的细胞电生理状态稳定,膜状态较好,但是胰酶对某些蛋白损伤很大,比如N ...
问:【求助】蛋白酶活性的测定方法:要对菌株进行蛋白酶的活性测定,不需要提纯,有什么合适的方法?同时介绍一下进行测定时以酪蛋白为底物的发酵培养基怎么配置?因为酪蛋白很难溶解。 答:你要一边加热一边调PH,碱性下酪蛋白会融解。用氨水或稀的氢氧化钠溶液调节,溶解很简单的。 答:蛋白酶的测定基本上都是经典的方法了,就是以酪氨酸做标准曲线的那个方法了。这是我测定蛋白酶的方法,先用酪氨酸作标准曲线。 &nbs ...
问:我用pH7.0 5mMTris-HCl缓冲液,含5mMCaCl2、0.02%叠氮化纳、0.5MNaCl,在4℃条件下提取黄鳝胰蛋白酶。具体方法是先将内脏打碎,离心,再用BAEE作底物在25℃,247nm处测胰蛋白酶活性,总是无功尔返。 不知道胰蛋白酶跑哪里去了,是酶失活还是自溶了,甚至是根本就没有分泌胰蛋白酶,怎样进一步保持酶的活性,恳请各位多多指教!本人不胜感激! 答:原因分析如下: 1、 ...