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shally1108：我要做神经母细胞瘤细胞和神经胶质瘤细胞的转染。本来是用LP2000，现在想试试电转，只做瞬时表达看绿荧光就行，不需筛选。 请问肿瘤细胞的瞬时转染合适吗？把细胞消化后只用PBS重悬可以吗？电压电阻大概多少？ 丁香园网友shally1108认为： 还有个问题，实验室用的是细胞电融合仪ECM2001（BTX），它的转染杯是仪器配套可重复使用的还是一次性用自己另外买的？ 此外，我的质 ...

xuwenpku：用pTRACER转染293细胞，约70-80%汇合度，3μl lipo，2μg质粒，36h后没有表达荧光，请教可能是什么原因？另外，想问是不是lipofectamine转染，要求细胞必须是传代之后24小时以内的细胞？延长转染时间是否会有好处呢？ 在另外，pTRACER这个质粒由那位同学用过么？它的荧光表达好不好？ 丁香园网友guoguo1984428认为： 你可以用P ...

犯罪现场调查：最近作稳定转染的筛选。发现一个问题。绿色荧光细胞总是在没转染成功的细胞附近生长。而且，混合生长。怎么才能分离？难道加大418的浓度？ 丁香园网友chenlydd认为： G418加压后活下来的细胞都是转染成功的。不表达绿色荧光的细胞不代表没有转染成功，该细胞只表达新霉素磷酸转移酶基因，因而对G418产生抗性，只是该细胞不表达目的基因。 分离只表达目的基因的细胞最好用９６孔板用有限稀释法 ...

荧光素酶作为一种报告基因要在检测时比较其相对发光强度值，就要在转染时引入另外一个报告基因进行转染条件、效率的标准化归一。Promega公司在这方面有双荧光素酶检测试剂盒，就是转染时同时转入两个质粒，包括萤火虫荧光素酶催化的反应和海肾（一种来自海洋的生物发光动物──三色堇）荧光素酶催化的反应。下面是说明书的一段原话： Firefly and Renilla luciferases，because ...

羽缎：我用磷酸钙转染293T细胞，以前做得都好好的，但最近有好几次都转染后八到九小时换液，发现细胞不但不增殖，反而死了2/3，排除细胞污染的原因，HBS也换了，都找不到原因。 丁香园网友wfayew认为： 转然后8-9h？我们都是16小时 那么短的时间细胞还没有适应转染环境吧可能影响转染效率 肉眼观察你的沉淀是否均匀？如果混合时不小心的话形成大块沉淀对细胞刺激还是很大的 做没有质粒的对照组看是否转 ...

llemontree：G418 筛选Hela细胞的预试验，想确定筛选浓度，怎么1500μg/ml 仍有细胞存活呢？难道Hela细胞的抗性如此之强？应该怎么办呢？急！ 丁香园网友qiuying认为： 可能细胞已改变了遗传特性，建议重新引入HELA细胞或更换细胞株。我曾用过G418筛选转基因的HELA细胞，浓度为700μg/ml时细胞已死 丁香园网友llemontree认为： Hela 细 ...

爱吃葡萄的猫：我做稳定转染，挑完单克隆用RT-PCR鉴定时，批不出我转染的那段基因表达，但是载体上的新霉素抗性基因能批出来，我鉴定了大概20个单克隆都是这样，开始以为是引物有问题，后来鉴定瞬时转染时能表达，应该就不是引物和条件的问题。大家有没有遇到过这种情况？帮我分析一下是什么原因？急等！ 丁香园网友Sayid认为： 这种情况太常见了，也是我们还要对抗性阳性克隆进行PCR鉴定的直接原因。 由于目的 ...

独1无2：我用带GFP的质粒转染到Ca Ski 细胞可见GFP的表达，但是一天后用同样的质粒转染到BJ 细胞23小时却没有看到任何荧光，在细胞周围看见疑似细菌污染，请问细菌污染会影响质粒的转染吗？ 丁香园网友爱吃葡萄的猫认为： 我觉得应该会，因为我觉得转染对细胞也是一种损伤，所以要求转染前细胞要处于对数生长期，也就是最好的状态，但是细菌污染就会影象细胞的生长状态。但是我觉得你这次没有成功也有可能还 ...

mapan777： 不知道哪位能告诉我IL-12、IL-12p40、IL-12p35、IL-12p70之间的关系是什么啊？ 丁香园网友qdwanfeng2007认为： 我也正想研究il-12，希望能和你共同探讨一下，P40和P35是P70的两个亚基吧？ 丁香园网友mapan777认为： 是的，它们联合起来起作用，我想做PCR，但是快被这个引物折磨死了，不知楼上是要做什么? 丁香园网友qdwanfe ...

rumex：请问大家核型分析用的显微镜是什么型号的，放大倍数是多少 丁香园网友q0134134认为： 核型分析一般用研究级正置荧光显微镜，放大倍数400-1000倍，要求具有核型分析功能的软件，MetaSystems很好用。 丁香园网友rumex认为： 为什么用荧光显微镜呢我想在镜下看到染色体400-1000倍能做到么？ 另外我们也想买台荧光显微镜那么要选择什么样的荧光纤维镜参考什么参数呢？ 丁香 ...

问：对比了dna ladder的实验方法和一些公司的dna ladder提取试剂盒，发现关键的区别就在回收DNA LADDER的柱子上。由于经费有限，请问提取质粒或是回收试剂盒中的柱子能够用于回收DNA LADDER吗？ 答：实验操作步骤： 1、 Harvest cells and pre-cold PBS rinsing once 500 g centrifuge 5 min Room Temp ...

dna2：我研究重组MVA疫苗，构建了survivin和IL-2重组的MVA病毒，并用病毒感染的DC细胞刺激自体T细胞，进行Survivin特异性的杀伤实验。条件如下： 外周血分离单核细胞（体外诱导分化为DC）和T细胞为HLA-A2阳性 DC与T细胞1：10刺激一周后重复刺激，并补加IL-2，两周后进行杀伤反应 survivin特异性多肽预处理的T2作为靶细胞，非特异性多肽预处理的T2作为对照 效 ...

1、脾细胞和骨髓瘤细胞一般按2：1-5：1的密度混合，有的报道可以到10：1，不过总体来说我们常选3：1-5：1，记住，原则是脾细胞的数量比骨髓瘤的多。 2、融合前，一般用HAT培养基做饲养细胞铺板，这是融合前的准备工作，因为饲养细胞分泌的某些细胞因子有助与融合的杂交瘤细胞生长，并且提供一定的细胞密度。通常是可以融合前一天做饲养细胞，老鼠选ICR或是BALB/C与ICR杂交的鼠，一只老鼠可以铺2- ...

firstofjk：大家好，如何在一个真核细胞表面连接上一段DNA呢？ 另外如何让真核细胞表面呈正电荷？ 丁香园网友雾失楼台： 为啥要这样做呢？ 丁香园网友Sayid认为： 有意思，我也大胆设想下 1，膜外侧带正电一般需要高盐高电离环境，我觉得稳定改变细胞表面电位还是比较难的，尤其是会影响细胞活性，听说过一种负驻极化膜，可以保持创面表面负电位的，但是细胞水平没听说 2，一般可以用某种含长链脂烃的双 ...

justinlee719：请教有关质粒共转染的问题！！！！！ 我在做RNAi方面是新手，现在已经构建好载体，正准备转染，我选用的载体是ambion的Psciliner3.1H1-neo，说明书上说质粒里面带有GFP的干扰序列，需要用带有GFP的质粒共转染来做阳性对照，我对这方面现在还不太明白，我想请教一下各位老师对于这个带有GFP的质粒的选择有什么具体要求吗？另外有哪些质粒是专职表达GFP的呢？各 ...

qdshlyykqk：我是新手，正在进行肿瘤细胞的GFP转染，有些问题想请教大家。因为在网上看到大家众说纷纭，一时拿不定主意。 1、利用转染之前的细胞进行G418筛选来确定最佳筛选浓度，是以1周还是2周完全杀死细胞为标准？有人说以1周的浓度作为将来转染之后的快速筛选阳性细胞的浓度，在对照组的为转染细胞大部分或全部死亡之后，以上述2周时的浓度作为维持浓度。有人说维持浓度应该是筛选浓度的1/2。究竟有 ...

yangbinxia：有没有人用脂质体转染过COS-7细胞呀？我看invergen lipofectamin 2000说明书上说这个细胞系转染效率99%，但我用GFP转染后40小时荧光显微镜下观察转染效率没有那么高仅有30－40%吧。可能我的转染条件不太好，我用的转染体系是1μg质粒加2μl脂质体/孔（24孔板）转染前一小时换无血清DMEM，转染后4小时换上10%FBS 的培养基。阳性 ...

cai_xiehe：各位战友，帮我看一下我们的培养的第二代SD大鼠骨髓间充质干细胞形态如何，能否拿去做流式细胞鉴定和慢病毒载体转染实验，万分感谢！ 再发一张也是第二代SD大鼠骨髓间充质干细胞图片 丁香园网友huli317认为： 想问问你这细胞是传代后多久的？ 这细胞形态真的太差了，特别是第二代就这种形态，你接下来的实验怎么完成啊 用作流式检测以及病毒感染都要细胞状态非常好，你要做流式怎么也得4到 ...

bixin1220：这几天做western条带出现了奇怪的现象。 band变成空心了，还有actin条带像PCR一样拉长了，请各位能人帮忙，指点谜径。 这是actin，我这是用细胞，分细胞质里的蛋白和细胞核里的蛋白做了western blot。细胞质里的蛋白actin就变成这样了，细胞核里的actin就正常。是不是我分得不对了就出现这种情况？我用RIPA buffer 提取蛋白的。 这是核 ...

summerray：请教如题，在脾细胞与瘤细胞融合时的一些问题 1 半分钟内加入PEG后静止一分钟前需不需要稍微吹匀呢，此时有不均匀细胞团块。 2 加入不完全培养液中止聚合后，需不需要先吹匀再离心呢，此时细胞团块在底部。 3 如何避免每个孔内是单个克隆呢，往往有好几个。 4 有限稀释法克隆化时有没有不计数的方法呢，肯定是有（很久以前一个老师那样做过，很难联系），如何操作呢。 多谢！ 丁香园网友yu ...