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1、做液闪仪测心肌细胞线粒体ANT转运酶活性检测，请问有没有非超声破膜的方法（没超声破碎仪）？ 2、若提得线粒体，如何看它有没有活性呢，用詹那绿B 就可以么？ 3、液闪仪大概需要多少样本量？ 丁香园网友dhh认为： 提取新鲜心肌组织细胞内线粒体的方案： 1、心肌组织切碎后在4℃介质（0.25 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl pH7.4，0-4℃）中制备心肌组织匀浆。匀浆经75 ...

ayao0问：前几天学习做细胞脂质体转染 看师姐是用的加血清的培养基，整个过程比以前的方法简单方便了很多 不用过四个小时就去换液，可以过了48个小时看转染效率很不好，以前也有人用这种方法做过，很成功。 到底这种新的方法行不行的通，做的时候需要注意哪些问题 丁香园网友kikie认为： 用的是invitrogen的lipofectamine2000，说明书上明确说可以用含血清的培养基： Prepare ...

pazj：我的细胞转染48h后在荧光显微镜观察，细胞形态还正常，消化传代以后加G418做稳转，加药以后头两天看，细胞形态还是正常的，但是第三天开始就缩小成小圆点了，感觉就和加胰酶消化后的细胞形态，不知道这个时候细胞是死是活？我还要继续加药吗？还是重新做转染？ 丁香园网友lanniaoxxx认为： 这种情况应该是细胞死亡的形态表现。建议仔细回想步骤，并查找文献，重新做转染 丁香园网友wlnju认为： ...

bioangelwx15问： 本人刚做慢病毒赶染实验，有些问题还不懂，想请教下大家，病毒感染细胞时是不是只要病毒的量够就行了呢？是不是病毒滴度大就少加病毒液，滴度小就多加呢？当然，前提是我要保证感染的细胞有充足的氧气供应，即使病毒液多加也有氧气供应，只是我不知道病毒浓度大小对感染细胞的效率有影响么？也就是说当病毒总量一定，病毒滴度大感染时加的量少和病毒滴度小，感染时加的量大，感染效率会不会一样呢？ ...

问： 有些细胞生长周期很长（如83hours），如果转入诱导其凋亡的质粒后，生长会更慢，细胞数目会更少，这类细胞用什么方法比较容易得到稳定细胞株？希望有经验的战友给予帮助，非常感谢！ 答： 如果你转入的是有诱导凋亡的基因，那么这时是得不到稳定细胞株的。建议你改用诱导表达型的载体，先筛选得到稳定的细胞株，然后在实验的过程中，当你需要激活基因表达时，只需要加入诱导剂（比如强力霉素等），这时你就可以观察 ...

问： 最近做细胞转染，预筛选稳定克隆，载体为pEGFP-N1，pIERS 现在是平行做几个基因，转然后，只有空载体和一个基因可以看到绿色荧光，其余均没有，这会是什么原因呢？怎么补救啊？ 答： 需要考虑的问题有： 1.你的细胞和转染的方法，是不是你的细胞本身就很难转染，有些细胞用脂质体转染率很低的。在求助时最好告知细胞和具体的转染方法和试剂。 2.质粒的纯度和质量：看你使用那种试剂盒提取的，我们的经 ...

问：我要用上清液做Elisa，但是上清液中的蛋白浓度不够，请问有什么方法可以把蛋白浓缩一下? 答：蛋白质浓缩技术是免疫学中常用的手段，现介绍几种常用的浓缩技术。 1、透析袋浓缩法 利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6 000－12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂 ...

qdshlyykqk： 我最近对肿瘤细胞转染GFP，其中不含有其他外源性基因。转染后短期内发现阳性细胞非常多，可是随着时间及细胞的增殖，培养孔内的细胞总数在不断的增加，但是发绿色荧光的细胞反而较以前少了（培养液中一直加着G418）。另外，转染后进行有限稀释单克隆的筛选，筛出来的单细胞长成克隆（大约1周）是发光的，但到两周的时候，荧光却消失了。请问这是什么原因？如果我想筛选出整合到宿主细胞染色体中的 ...

maoliping70：pEGFP-N1为载体表达的核蛋白要确证表达于核内的方法为用PI染色，PI只与核酸结合，在488nm激发下发红光，而GFP发绿光，红光与绿光重叠发黄光。还有以下疑问： 1.作为对照的pEGFP-N1空载体转染细胞后表达的GFP蛋白为27KD，能自由通过核孔复合体，也就是说GFP在核内也有表达，那会与PI重叠发黄光影响测定吗？ 2.有提出GFP在细胞固定时，会从细胞漏出，那细 ...

feiqi：最近我从别人处拿到一种稳定转染的细胞，他让我用G418稳定细胞系，但是我不知道我所拿到的细胞是否真的稳定转染了我所需要基因，怎么进行鉴定？谢谢！ 丁香园网友kevinfong认为： 第一，看看是不是G418抗性的。第二，采用Western检测你所需的基因是否表达，但必需和内源性的比较，如果这个细胞本身不表达你的目的基因那就不需要比较了。第三，你也可以提基因组做PCR看目的基因是否整合， ...

tydyhan： 我一直做细菌这块，对病毒操作不是很懂，请教大家： 建立表达某基因的重组逆转录病毒载体的B16细胞系 含某基因的重组逆转录病毒载体已获得，需转染PA 317包装细胞，通过G418筛选获得表达某基因的重组逆转录病毒。Polybrene进行转染B16细胞，筛选阳性转化克隆，获得稳定表达的B16细胞株。这里怎么具体进行操作?? 丁香园网友adychen认为： １、首先最好选择的是带ＥＧＦ ...

wangcaixia1： 我是第一次做蛋白表达，所表达的蛋白是以包涵体形式存在的，包涵体经过洗涤、溶解后进行复性，采用不同尿素浓度（4.5、3.5、2.5、1.5、0.5、0）的复性缓冲液进行复性，我想请教的问题是这一系列不同尿素浓度的复性缓冲液可以重复使用吗？如果是不同的蛋白可以重复使用吗？ 丁香园网友panmo2006认为： 不知道你用的是哪一种表达载体，如果是融合表达载体pGEX时候，在透析 ...

问： 我要用6孔板作蚀斑减少试验，但是琼脂dmem加到孔里，还没加完6个空，杯子里的就已经凝固了，琼脂和dmem都是在50度水浴里的，混合后赶紧加，但是来不及。有什么办法能很舒服的加进孔里去又不凝的太快吗？ 答： 做蚀斑减少试验最关键的就是铺胶时动作即要缓慢，以防止气泡产生同时动作要快，一般六孔板加2-3毫升就够了，你可以用10毫升的吸管吸够10毫升可以加四格孔，在50度水浴里化开的琼脂完全可以加 ...

问：神经干细胞nestin和EphrinA4的免疫荧光双标怎么做？ 答： 过程和一般的免疫染色一样就是封闭的时候用两种血清混合封闭1：1 加入一抗和二抗的时候也是混合加入 但是因为稀释浓度不好掌握最好提前作预试~ 补充一点，荧光双标记必须选择的一抗抗性不同，如一个是兔多抗，一个是鼠单抗，那么二抗分别采用抗兔，抗鼠的不同颜色标记的荧光二抗即可。 ...

问： 单克隆抗体制备过程中在往BALB/C小鼠腹腔折注射的液体石蜡要如何处理？要高压吗？先谢谢各位！ 答： 液体石蜡不用高压，BALB/C小鼠腹腔注射0.5-1毫升，视具体情况增减，注射过液体石蜡的BALB/C小鼠，2个月内都可以使用。 ...

pl198242：请问各位大侠：用质粒提取试剂盒从大肠杆菌中提取质粒后，想用于细胞转染，还需要另外的操作来除菌么？ 另外是否还需要纯化？ 丁香园网友boboyuan认为： 不需要，当然，前提是你提取质粒时操作是规范的。 提完的质粒放－4度保存，转染的时候直接用就行了。 丁香园网友hzh_0796认为： 看你是用什么方法提得，纯度如何 我用小提的时候发现，最后一步用洗脱液洗时将吸附柱放进一个新的EP ...

报告基因的种类很多，根据对其表达产物的分析检测方法的不同，可将其分为体外报告基因和体内报告基因。前者的分析需要在含有报告分子的细胞裂解液或细胞、组织培养液（分泌型报告基因）中进行报告分子的定量。较典型的有氯霉素乙酰基转移酶基因（CAT）、人生长激素基因（hGH）及分泌型碱性磷酸酶基因（SEAP）等。后者的分析可以在活的细胞或组织中，或在已经组化固定的组织或细胞中进行。较典型的如绿色荧光蛋白基因（G ...

cvn：请大家分析下我的问题：本人用六孔板共转染（pAAV-IRES-hrGFP、pRC、phelper）包装空载体腺相关病毒，转染后48小时在荧光显微镜下看，一个视野内约有80%的绿色荧光。转染后第三天，收病毒。再将病毒原液感染种在六孔板内293细胞，48小时后在荧光显微镜下未见绿色荧光蛋白。 上述的过程，本人重复了三次。均未见绿色荧光蛋白。现在本人感到疲惫。请大伙帮忙分析分析。谢谢！ 本人用脂 ...

gdgznf2008：大家看看我的293细胞状态怎样？ 适合转染吗？ 下一张 下一张 下一张 下一张 丁香园网友pmy5155714认为： 不太好至少你的细胞长的太不均匀了 而且有的细胞已经老化消化的问题 丁香园网友gdgznf2008认为： 我的细胞是师兄冻存的，也不知多少代了，我用的是0.025的胰酶＋EDTA消化的，而且尽量吹打均匀，可接种后仍然长的不均匀，呈片状生长。我 ...

paipaihe：24孔中，对已成功转染GFP的细胞进行免疫细胞化学检测 1抗使用GFP 单抗（鼠源） 2抗使用羊抗鼠的HRP标记2抗 经染色后未见任何阳性显色细胞， 请问各位可能的原因都有那些呢？ 我的具体操作是 1.4%多聚甲醛固定30分 2.triton-100 透化 15分 3.3%H2O2/甲醛 10分 4.5%BSA 60分 5.1抗 60分 6.2抗 60分 7.染色 ...